文档介绍：摘要
摘要
家蝇是一种重要的资源昆虫,长期生活在各种恶劣的自然环境中,具有优
良的免疫防御系统。抗菌物质在免疫防御系统中具有重要的作用,对家蝇抗菌
物质及其在免疫系统中作用的研究具有重要的理论意义和应用价值。
为研究家蝇免疫防御系统的抗菌物质,本研究采用酸法提取家蝇千蝇蛆抗
菌物质进行抗菌活性的研究。结果表明提取的物质能够显著抑制大肠杆菌和金
黄色葡萄球菌的生长,性质和结构分析表明该物质为非蛋白类的抗菌物质,具
有家蝇甲壳素壳聚糖的一些典型特征,推测为家蝇低分子量壳聚糖。
为研究家蝇低分子量壳聚糖生成的分子生物学基础,本研究采用同源克隆
并结合末端快速扩增技术克隆了家蝇几丁质酶全序列和甲壳素脱
乙酞酶片段,并对几丁质酶序列进行多序列比对、结构域分析、
高级结构分析、进化树构建等生物信息学分析。结果表明家蝇几丁质酶
序列全长登录号,包含一个
的开放阅读框,编码个氨基酸。成熟的几丁质酶蛋白质分子由个
氨基酸组成,分子量为,理论等电点。家蝇几丁质酶氮基
酸序列的位为信号肤,位点为几丁质酶活性中心位点,
位点为糖基化位点,位点为几丁质结合位点。家蝇几丁质
酶催化区域的高级结构特征是桶状折叠,内部由个平行的一链组成,
外壳由个。一螺旋构成。家蝇几丁质酶和果蝇及舌蝇几丁质酶相似度最高,位
于进化树的同一个分支上。甲壳素脱乙酞酶克隆得到了长度为帅的片段。
为获得纯的家蝇低分子量壳聚糖,本研究以家蝇幼虫为材料,研究了家蝇
甲壳素提取和低分子量壳聚糖的制备工艺及动力学。家蝇甲壳素提取的优化工
艺为培养的家蝇幼虫匀浆,离心得到蛆皮蛆皮用在℃作
用脱蛋白用高锰酸钾浸泡脱色,接着用的草酸浸泡去除
残余高锰酸钾用几的盐酸室温浸泡除灰分干燥即得到白色片状家
蝇甲壳素。家蝇甲壳素的收率达到干重,残余氮含量达到,残余
灰分含量为。壳聚糖制备的优化工艺为按照的比例将家蝇甲壳
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素悬浮在的溶液中,℃连续反应,脱乙酞度可达到
连续反应,脱乙酞度可达到。甲壳素脱乙酸反应的动力学方程为
竺卫
家蝇低分子量壳聚糖的制备采用氧化降解法。降解的优化工艺为壳聚糖
溶解在的乙酸中,终浓度为,加入过氧化氢使终浓度为进行反应,
反应温度为,在不同的反应时间终止反应即可得到不同分子量的壳聚
糖。降解的动力学方程为
一一
为研究家蝇低分子量壳聚糖的抗菌活性及机理,本研究利用降解得到的
个不同分子量的家蝇壳聚糖,对种细菌做体外抗菌实验,研究不同分子量壳
聚搪的抗菌活性及影响因子。并通过测定细菌细胞透性变化和透射电镜观察细
胞的完整性,研究壳聚糖的抗菌机理。结果显示不同分子量的家蝇壳聚糖对测
试的种革兰氏阳性菌和种革兰氏阴性菌都有显著的抗菌活性,抗菌效果受
到壳聚糖的分子量、溶液、菌株类型、溶液金属离子浓度、壳聚搪的浓度等
因素的显著影响。随着粘均分子量的增大,壳聚搪的抗菌活性显著降低,在测
试的个不同分子量的壳聚搪中,粘均分子量为的低分子量壳
聚糖抗菌活性最强。也是壳聚糖抗菌活性的极显著影响因素,随着的降
低,壳聚糖的抗菌活性显著增强。这说明壳聚搪分子中有效的数量是其抗
菌活性的关键因素之一。统计结果还显示壳聚糖抗菌活性的高低是由分子量、
菌株和共同决定的,即壳聚糖对特定菌株的抗菌效果只有在特定的和特
定的分子量下才最明显。金属离子会显著降低壳聚糖的抗菌活性,特别是
和。推测壳聚糖和环境中金属离子结合使其不能被细菌所利用也是其抗菌
原因之一。壳聚糖的最小抗菌浓度随分子量和菌株的不同而不同,活性最高的
壳聚糖对种细菌的最小抗菌浓度为。不同来源壳聚糖的
抗菌活性基本一致,但在有金属离子存在的条件下,家蝇壳聚糖的抗菌活性明
显高于蟹壳壳聚糖。壳聚搪会使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞壁和细胞膜
的透性增加,造成细胞胞内物质的外流,这可能也是壳聚搪的抗菌机理之一。
摘要
电镜观察显示低分子量的壳聚糖能够造成细菌细胞壁和细胞膜的破裂,
高分子量的壳聚糖能够结合在细胞壁外表面,从而造成细胞死亡,说明
不同分子量的壳聚搪抗菌机理不同
家蝇壳聚搪还具有抗真菌活性和诱导植物抗病性的能力。壳聚糖能有效抑
制真菌的生长,培养后,的壳聚搪对苹果轮纹病菌和立枯丝核菌的抑
制率达到以上,对花生尾抱菌的抑制率达到以上,对可可刺盘抱的抑
制率达到以上,对黑曲霉和黄曲霉的抑制率在,对黑根霉的生
长没有抑制。溶液值会影响到壳聚糖的抗真菌活性,从降低到
生长抑制率提高了。壳聚糖的浓度对抗真菌活性有显著影响,抗真菌
效果随着浓度的增高而增加。用不同分子量的壳聚糖处理黄瓜叶片,均能使叶
片的和酶活性提高。在作用后