文档介绍：上海交通大学
硕士学位论文
RNA干扰逆转胃癌细胞耐药性的研究
姓名:张艳红
申请学位级别:硕士
专业:内科学(消化病学)
指导教师:王兴鹏
20080501
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符号说明中英文对照
英文缩写英文全称中文注释
DDP Cisplatin 顺铂
DMSO dimetyl sulphoxide 二甲亚砜
RI resistance index 耐药指数
FCM Flow Cytometry 流式细胞计量术
PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
GFP Green Fluorescent Protein 绿色荧光蛋白
siRNA small interfering RNA 小干扰 RNA
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日期: 年月日
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日期: 年月日日期: 年月日
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RNA 干扰逆转胃癌细胞耐药性的研究
摘要
背景与目的:胃癌严重威胁着我国人民的健康,相当一部分病人因
为肿瘤对化疗药物产生耐药性导致肿瘤无法控制而死亡。肿瘤耐药性的
产生极大地限制了抗肿瘤药物疗效的发挥。RNAi 可以作为一种简单有效
的代替基因敲除的遗传工具,封闭目的基因的表达。从而使肿瘤细胞对
化疗药物恢复敏感性,这对于提高肿瘤患者的化疗效果和延长患者生存
期具有非常重要的意义。本实验将最新的 RNA 干扰技术应用于肿瘤化疗
领域中最为关切的难题。选择 MRP4 这个重要的耐药相关蛋白作为靶点,
设计针对于它的基因序列的特异性 siRNA,通过慢病毒载体将其应用于
胃癌耐药细胞株,从而在体外研究 RNA 干扰逆转胃癌细胞耐药性的作用。
方法:1. 采用逐步递增 DDP 浓度方法诱导细胞耐药。MTS 法测定化
疗药物的细胞毒性作用,基因芯片筛选胃癌耐药相关基因,RT-PCR 及
Western blot 检测所筛选出的耐药株中高表达的 MRP4 基因的表达。2.
针对 MRP4 基因设计 4 种 RNAi 靶序列,合成靶序列的 Oligo DNA,退火
形成双链 DNA,与经 Hpa I 和 Xho I 酶切后的 pGCL-GFP 载体[含 U6 启动
子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接,PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定。用连接
后的 pGCL-GFP,pHelper (gag/pol 元件)和 Helper (VSV-G 元
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件)质粒共同转染到 293T 包装细胞内,荧光显微镜下观察包装细胞基因
表达情况,收集病毒上清、浓缩、测定重组病毒滴度。将 4 种慢病毒重
组载体 LV-shMRP4 分别感染胃癌 SGC7901/顺铂耐药细胞,并进行
Real-time PCR 检测,筛选出包含最佳有效靶序列的慢病毒重组载体
LV-shMRP4。3. 含最佳有效靶序列的慢病毒重组载体 LV-shMRP4 感染胃
癌 SGC7901/DDP 耐药细胞,Real Time PCR 及 Western blot 分别检测感
染前后 MRP4 基因在 mRNA 及蛋白水平的表达变化, Annexin V-FIFC 检
测细胞凋亡情况,及 MTS 检测慢病毒重组载体 LV-shMRP4 抑制 MRP4 表达
后 SGC7901/DDP 药物敏感性的改变。
结果:1