文档介绍：原理蛋白质分子在溶液中由于其末端氨基、末端羧基及侧链的游离基团而成为带电颗粒,并可在电场内移动,其移动方向取决于蛋白质分子所带静电荷。不同蛋白质分子根据其氨基酸组成及所在溶液的 pH 值,携带的静电荷不尽相同,致使它们在电场中的迁移率各异,从而达到分理的目的。电泳原理示意图在蛋白质组学中对电泳的分类一维电泳(one dimensional gel electrophoresis, 1DE) ,现在普遍采用垂直板聚丙烯酰***凝胶电泳( PAGE ) 二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE) ,又称双向电泳一维电泳现在普遍采用聚丙烯酰***凝胶电泳( PAGE ),包括非变性电泳(native PAGE) 和 SDS-PAGE 两种,前者主要是在分离蛋白复合物时经常用到。后者是在凝胶与缓冲系统中加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠( SDS ),蛋白质分子被大量 SDS 阴离子包裹,消除了它们间原来携带的电荷差别,因而其迁移率仅反映蛋白质分子大小,故广泛用于蛋白质分子量的测定。凝胶浓度和蛋白质分离范围缓冲液的选择通常在 SDS-PAGE 均选择 Tris-glycine 作为电泳的缓冲系统。但在大部分缓冲系统中, SDS 微团(micelle) 会干扰小分子蛋白质的分离,而 Tris-tricine 系统则可使小蛋白质- SDS 复合物与微团分离,去除干扰。此外,也证明该系统对脂多糖和脂寡糖混合物的分离有效。 12% 胶常用的低分子量标准蛋白名称来源分子量磷酸化酶 B兔肌肉 97400 牛血清白蛋白牛66200 卵清蛋白鸡蛋清 45000 碳酸酐酶牛31000 胰蛋白酶抑制剂大豆 21500 溶菌酶鸡蛋清 14400 一维凝胶染色现在用于凝胶中蛋白染色的方法包括氨基黑 10、考马斯亮蓝 R250 、考马斯亮蓝 R350 、银染、铜染及橙染(sypro orange) 。最常用的为考马斯亮蓝 R250 、考马斯亮蓝 R350 染色,为了提高灵明度采用银染。一维电泳的应用初步测定蛋白质的分子量初步分离蛋白质复合物,并进一步用于免疫组化分析对重组表达蛋白的初步鉴定将一维电泳和生物质谱相结合,达到对较简单蛋白复合物的分离和鉴定一维电泳在蛋白质组研究中的应用举例我们将一维电泳和 LC-Ms/MS 结合,成功进行如下研究: (1) 血浆蛋白质组研究(2)SARS 病毒蛋白的分析鉴定,成功鉴定了 SARS 病毒的 S蛋白、N蛋白和 E 蛋白,有力推动了我国第一个 SARS 疫苗的研究和申报工作。双向电泳(2DE) 原理: 2DE 就是第一向采用等电聚焦分离,第二向为 SDS-PAGE 分离。由于 2DE 是依据蛋白质的两种不同性质,即等电点和分子量进行分析,因此分辨率远高于其他任何一种单一的电泳方法,是目前分析混合蛋白质样品最有效的手段。(注意:双向电泳中的“双向”指的是按照蛋白质的两个性质即“等电点和分子量”进行分离的原理。)2DE 仪器系统 2DE 在蛋白质组学方案中所处的位置这就是将 2DE 和质谱相结合进行比较蛋白质组分析的实验方案。(方案完后) , 下面,我将汇报用以上介绍的方法进行脾淋巴细胞及乳腺癌比较蛋白质组学的实验结果。双向电泳的操作程序(以进行差别表达蛋白组分析为例) strips 重泡胀及上样(rehydration and liading) ,包括还原和烷基化 -PAGE ,普遍采用预制的固定 pH梯度胶条(immobilized pHgradient strips, IPG strips) 。商品化的 IPG strips 可以从 Amersham Pharmacia 公司或 BioRad 公司购买。 IPG 胶条制备(casting ofIPG strips) IPG slab gels with linear gradients pH4-7, 4-9, 6-10 and 4-12 are cast according toG?rgetal. (1986) with the recipes ofRighetti (1990) and G?rgetal. (1998). Two starter solutions (an acidic one and abasic one) are prepared as described inTable better polymerization, the acidic and basic solutions are adjusted topH7with sodium hydroxide and acetic ac