文档介绍：用根癌农杆菌介导EPSPS基因遗传转化拟南芥的研究:根癌农杆菌介导法

　　摘要：研究经过花序浸染法，将EPSPS基因导入拟南芥(Arabidopsisthaliana)Col(Columbia)生态型植株中，经过卡那霉素对种子的抗性筛选及常规PCR对再生植株进行阳性判定。初步证实，EPSPS基因已经成功转化拟南芥，经过重复筛选，取得转基因纯系植株。
　　关键词：拟南芥；PCR检测；EPSPS
　　中图分类号：Q946文件标识码：A文章编号：1674-04322021-04-0060-2
　　拟南芥是经典的十字花科植物，因其独有的生物学特征而成为生物学研究者常见的模式植物，被誉为植物界的“果蝇”。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶EPSPS，是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包含色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶，参加生成生物碱、维生素、香豆素、吲哚类衍生物、酚类、类黄酮和木质素物质等次生代谢物的合成。当给植物喷施草甘膦时，草甘膦和EPSPS结合，阻止了此酶的活性，造成氨基酸合成受阻，随即植株死亡。农业上用除草剂草甘膦就是依据这个原理消亡植物的。其中G2-aroA基因是来自草甘膦生产厂周围污染土壤中的荧光假单胞菌，该基因编码的EPSP合酶作为植物体内源EPSP合酶的同功酶，其构象差异造成对草甘膦亲和性下降，从而使植株取得抗药性。为了研究EPSPS基因在拟南芥中的表示，我们采取花序浸染的遗传转化方法，对拟南芥进行遗传转化，得到转化后的种子。对转化种子进行抗性筛选，得到抗性筛选植株，并进行PCR检测，深入筛选阳性的转基因植株。
　　1材料和方法
　　材料
　　试验材料转EPSPS基因的大肠杆菌EPSPS-DH5α和农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEPSPS-EHA105由试验室保留。拟南芥生态型Col(Columbia)。
　　关键试剂植物凝胶WaKo，MS粉Sigma，卡那霉素BioBASICINC，CTAB，多种引物由英俊生物技术有限企业合成，TaqDNA聚合酶TiangenBiotech。
　　方法
　　拟南芥植株的培养将拟南芥种子在4℃冷藏箱中春化3d左右。将腐殖土和蛭石以2：1混匀，经高压灭菌后装入到直径为8cm的塑料盆中，用水将盆中的土壤浇透。把春化好的拟南芥种子用灭菌水浸泡24h后，用移液枪吸收，均匀的种植在盆中，并将小盆置于灌有自来水的大塑料盘中置温室中培养，温度恒定为22℃，置于短日照10h以下，温室中培养4周后转放到长日照条件下光照12h以上诱导抽苔开花。
　　花序法介导拟南芥的遗传转化1转化前准备拟南芥在温室或人工气候室生长到一定时间。当开始抽苔时，去掉主苔，大约一周后，次生苔高度大约5cm时，对植株停止浇水，准备进行遗传转化。2浸染液的制备将带有目标质粒的农杆菌EPSPS-EHA105单菌落接种于LB液体含Kan50mg•L-1培养基中，于28℃培养至OD600约为时，然后以6000rpm、4℃离心10min搜集菌体，将菌体在含有大量元素，微量元素，B5维生素，5%蔗糖，mg•L-1BAP，%silwetL-77的1/2MSpH为中重悬。重悬的菌液用于转化拟南芥。3拟南芥花序的浸染将重悬的菌液分装到烧杯里，将拟南芥植株花序淹没在浸染液中30s,