文档介绍：堤翔缘苗段姓祝黎免乾咸揖辖梨成窖险珠痢蔫漆丑迎伺午晰矗贯翘鬃需叔课题3 血红蛋白的提取和分离 (2)课题3 血红蛋白的提取和分离 (2)
课题背景
蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。
因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。
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(一)蛋白质分离的原理：
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
一、基础知识
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（二） 凝胶色谱法
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大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。
根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构凝胶的分子筛作用，来进行分离蛋白质的有效方法。
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（分配色谱法）
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小蛋白质
大蛋白质
混合物
上柱
洗
脱
大分子流动快
小分子流动慢
收集
大分子
收集
小分子
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①相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;
②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？
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（三）缓冲溶液
抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，
维持PH基本不变。
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通常由1－2 种缓冲剂溶解于水
中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。
3. 在本课题中使用的缓冲液是: 磷酸缓冲液,
成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠
如何鉴定凝胶色谱法分离得到的蛋白质是目的蛋白？
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（四） 电泳：
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带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
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①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
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琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰***凝胶电泳。
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在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物， SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别使其迁移速度完全取决于分子的大小
由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同
琼脂糖凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳（测定蛋白质的分子量）
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