文档介绍：A型口蹄疫液相阻断 ELISA 2015 年 12 月一、液相阻断 ELISA 基础知识?液相阻断 ELISA ( LB-ELISA )通途: ?1、检测口蹄疫感染,广泛用于国际贸易中,是 OIE 指定方法之一; ?2、监测牛、羊和猪等偶蹄动物血清中口蹄疫免疫效价,评价口蹄疫疫苗免疫效果。 BL-ELISA 原理图待检血清与病毒抗原混合液捕获抗体检测抗体病毒酶结合物显色液阳性不显色阴性显黄色? BL-ELISA 反应原理: ?将预先滴定好的病毒抗原与被检血清首先在液相中反应,然后将抗原抗体复合物转移到包被了口蹄疫特异性抗体的 ELISA 板中,没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被 ELISA 板中的抗体捕获,再通过酶结合物与底物显色。按照实验孔呈现颜色与抗原对照(未加血清)孔呈现颜色相比较判定结果。?抗体滴度以阻断 50% 病毒抗原的血清稀释度表示。二、实验前准备?1、使用前,试剂盒所有组份应回复到 18-26 ℃,试剂要混合均匀,每个样品使用一个吸头。?2、浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水 25 倍稀释。三、实验操作步骤?1、抗原抗体反应布板图2 96 孔酶标板检测 20 份样品布局图 1:4096 1 :256 1:2048 1:12 8 1:1024 1:64病毒抗原 1:512 S20 S19 S18 S17 S16 S15 S14 S13 S12 S11:32 1 :256 1:256 1 :128 1:128 1:81 :64 1:64 -1:4 +1:32 S10 S9 S8 S7 S6 S5 S4 S3 S2 S1 1 :32? 稀释病毒抗原:用配制好的洗涤液在孔外 6 倍稀释病毒抗原。? 待检血清稀释:在血清稀释板上,使用洗涤液连续 2倍稀释每份被检血清,每份血清稀释 2-8 孔,根据检测用途而定。使每孔最终量都为 50vl 。? 稀释阳性对照,参照步骤 ,连续 2倍稀释, 从1: 16-1 : 1024 。? 稀释阴性对照,参照步骤 ,连续 2倍稀释, 从1: 2-1 :4。? 血清稀释板加样:使用稀释好的病毒抗原加样,其中预设的 4孔病毒抗原对照孔按 100vl/ 孔加入,其余待检血清、阴阳性对照按 50vl/ 孔加入。加样完毕,所有样品孔和因阳性对照孔稀释度翻倍,变为图 1图、 2所示。? 将加好样的血清稀释板封板,置于 37 ℃反应 2h 。?2、样抗原抗体混合液及病毒抗原对照从血清稀释板上按次序转移到包被板上 50vl/ 孔,封板, 37 ℃反应 30Min 。?3、洗涤液洗版 5次,拍干。加抗体溶液 50vl/ 孔,封板, 37 ℃反应 35Min 。?4、同上洗板 5次,拍干。加酶结合物 50vl/ 孔,封板, 37 ℃反应 35Min 。