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蛋白质的盐析
蛋白质的盐析(验证型)
一、实验目的
了解在工业化生产过程中使用(NH4)2SO4的情况,及(NH4)2SO4使用时的注意事项。
二、实验原理
用高浓度中性盐使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法称盐析。常用的中性盐有(NH4)2SO4、NaCl等。高`浓度中性盐能使蛋白质沉淀是因为它具有脱水性,能脱去蛋白质胶粒水膜,又有中和蛋白质胶粒外双电层电荷的作用。不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同,故调节盐浓度,可适当地将蛋白质分开。如球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀,清蛋白在饱和硫酸铵溶液中沉淀,用盐析法沉淀的蛋白质并未变性,用稀释的方法或透析的方法可使之复溶。
三、器材与试剂
发酵溶液
10%的三***醋酸溶液
饱和(NH4)2SO4溶液
4、(NH4)2SO4粉末
四、实验步骤
取发酵溶液5ml,加饱和(NH4)2SO4溶液1ml2ml3ml4ml5ml,混匀,静止数分钟,即有白色沉淀析出,应为何物?过滤至清,除去沉淀,滤液备用。取少量沉淀,加H2O看是否复溶?
,加10%的三***醋酸数滴,有白色沉淀产生,应为何物?然后在721分光光度计OD600下进行透光率的检测,检测时必须在倒入比色皿以后10秒内读取(为什么)
。(在进行检测时应注意将721分光光度计调整到OD600;在测量前应把机器预热半小时左右。在检测时应注意有效的检测范围是T值15%以上到70%以下)。
另外,,加(NH4)2SO4粉末,随加随搅拌,直至(NH4)2SO4不能溶解为止,有白色沉淀产生,应为何物?然后过滤至清,除去沉淀,过滤备用。
将(1)-(3)做的滤液中加10%三***醋酸数滴观察有无沉淀产生。找到没有沉淀的加饱和(NH4)2SO4溶液的点。然后在721分光光度计OD600下进行透光率的检测。并且作出曲线。
对大量的发酵液进行处理,在滤液中加10%三***醋酸数滴观察有无沉淀产生。
盐析曲线的制作方法:如果要分离一种新的蛋白质和酶,没有文献数据可以借鉴,则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下:取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液,冷至0℃~5℃,调至该蛋白质稳定的pH值,分6~10次分别加入不同量的硫酸铵,第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时,记下所加硫酸铵的量,这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时,静止一段时间,离心得到第一个沉淀级分,然后取上清再加至混浊,离心得到第二个级分,如此连续可得到6~10个级分,按照每次加入硫酸铵的量,查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中,测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图,即可得到盐析曲线。
五、盐析注意事项:
,溶液pH值越接近蛋白的等电点,蛋白质越容易沉淀。
,容易吸潮,因而在使用前,一般先磨碎,平铺放入烤箱内60℃烘干后再称量,这样更准确。
,搅拌也要缓慢,越到后来速度应该更注意缓慢,如果出现一些未溶解的盐,应该等其完全溶解后再加盐,以免引起局部的盐浓度过高,导致酶失活。