文档介绍：6 种方法测定蛋白质含量[文章来源: |文章作者: |发布时间: 2006-12-25| 字体: [大中小] 一、微量凯氏( kjeldahl )定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨, 借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: nh 2 ch 2 cooh+3h 2 so 4—— 2co 2 +3so 2 +4h 2 o+nh 3 (1) 2nh 3 +h 2 so 4——(nh 4) 2 so 4 (2) (nh 4) 2 so 4 +2naoh —— 2h 2 o+na 2 so 4 +2nh 3 (3) 反应( 1)、(2) 在凯氏瓶内完成,反应( 3)在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化,可以加入 cuso4 作催化剂, k2so4 以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以 6. 25即得。二、双缩脲法( biuret 法) (一) 实验原理双缩脲( nh3conhconh3 )是两个分子脲经 180 ℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与 cuso4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰***基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、 tris 缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。(二) 试剂与器材 : (1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白( bsa )或标准酪蛋白,配制成 10mg/ml 的标准蛋白溶液,可用 bsa 浓度 1mg/ml 的 a280 为 来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 h2o 或 %nacl 配制,酪蛋白用 0. 05n nao h 配制。(2)双缩脲试剂:称以 克硫酸铜( cuso4 ? 5h2o )和 克酒石酸钾钠( knac4h4o6 ? 4h2o ),用 500 毫升水溶解,在搅拌下加入 300 毫升 10% naoh 溶液,用水稀释到 1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。 : 可见光分光光度计、大试管 15支、旋涡混合器等。(三)操作方法 :取 12支试管分两组,分别加入 0, , , , , 毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到 1 毫升,然后加入 4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温( 20~ 25℃)下放置 30分钟,于 540nm 处进行比色测定。用未加蛋白质