文档介绍：· 1· 第十章单克隆抗体技术( Monoclonal antibody technique ) 一、原理 B 淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。 B 细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种 B 细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力,又具有产生特异性抗体的 B 淋巴细胞的能力,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的 B 细胞融合。采用 HAT 选择性培养基(培养基中加次黄嘌呤 HyPoxanthine H ,氨基喋呤 Aminoopterin A 及胸腺嘧啶核苷 Thymidine T),在这种选择性培养基中,由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶, 所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成 DNA 。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成 DNA , 这一途径又被氨基喋呤所阻断, 所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶, 可以通过次黄嘌呤合成 DNA , 克服氨基喋呤的阻断, 因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。 B 淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长,一般于二周内均死亡。单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点: ①单一特异性,与一个抗原决定簇反应; ②可重复性,能够提供完全一样的抗体制剂; ③一经制出,可无限量地供应; ④生产单克隆抗体,不一定需要纯的抗原; ⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。单克隆抗体与常规的血清抗体的性质比较,见表 10-1 。表 10-1 单克隆抗体与常规抗血清的性质比较性质常规血清抗体单克隆抗体抗体含量少μ g/ml 多 mg/ml 无关的 Ig多少或几乎无· 2· 其它血清蛋白有少,培养物上清常有 10 %胎牛血清 Ag-Ab 结合免疫原的全部成分的全部抗原决定簇免疫原中的一种成分的一个抗原决定簇特异性亲和力的重复性不同批号间有变化无变化与其它抗原的交叉反应与带有共同抗原决定簇的抗原有部分交叉一般无。结合到共同决定簇则是完全的免疫球蛋白的种类与亚类完全是混合的只是一种或几种免疫球蛋白的物理性质典型光谱抗体的单一性质二、动物的选择与免疫(一)动物的选择目前应用最广的是小白鼠和大白鼠,尤以小白鼠为好。就品系而言以 Balb/c 小白鼠应用最广,因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从 Balb/c 小白鼠系诱导出来。 Balb/ c 系小白鼠必须用纯系的,雌雄均可,以 8~12 周龄为宜。大白鼠也可,能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上, 发展了小鼠-大鼠,小鼠-人以及人-人杂交瘤技术。(二)免疫一般而言,抗原的纯度不很重要,特别是免疫原性较强的抗原。免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的 B 淋巴细胞,一只纯种小白鼠估计能产生 × 10 7 ~ × 10 7 种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合,只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会,必须加强免疫,使产生特异性抗体的 B 淋巴细胞大量增加。 B 淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的 B 淋巴细胞可能更易于融合, 而免疫以后 7~8 天, 虽然是抗体产生的高峰时期,但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。 1 .可溶性抗原(蛋白质) 以 1mg/ml ~ 5mg / ml 的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化,分多点小鼠皮下注射,总量为 ~ ,间隔3~5周再同样注射一次,10天后,断尾取血一滴,测抗体效价,选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉(尾静脉)给予无佐剂抗原 ~ ,3~4天后,杀死小鼠取· 3· 脾做融合用。 2. 颗粒性抗原如抗原来源方便, 可以不加佐剂而增加免疫次数, 缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠, 以1%浓度每只皮下注射0 .2 ml , 每周2次, 共免疫 5~8次,取脾前3天,再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大,大到近于免疫耐受的程度更好。三、细胞的选择(一)脾细胞 1 .材料(1) 免疫过的血清抗体滴度高的 Balb/c 鼠。(2) 1640 培养液(3) % FCS - 1640 营养液