文档介绍：-1- 青霉素酶产生菌蜡样芽孢杆菌的筛选、纯化和诱导徐冰(天津农学院农学系) 1 前言β- 内酰***酶( 青霉素酶) 在自然界的各种细菌中广为存在, 能够水解各种β- 内酰***类抗生素, 是临床致病菌最重要的耐药机制之一。但同时我们可以利用许多非致病菌产生的β- 内酰***酶能够水解β- 内酰***类抗生素的特点, 开发其在抗生素药品质量检验、新抗菌药物筛选等方面的应用。一些抗菌药物如青霉素、磺***类药物、四环素及某些氨基糖甙类抗生素能使部分人群发生过敏反应。过敏反应症状多种多样, 轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛及蜂窝织炎等; 严重时可出现过敏性休克, 甚至危及生命。当这些抗菌药物残留于动物性食品中进入人体后, 就使部分敏感人群致敏, 产生抗体。当这些被致敏的个体再接触这些抗生素或用这些抗生素治疗时, 这些抗生素就会与抗体结合生成抗原抗体复合物, 发生过敏反应。英国一对青霉素高度敏感的病人, 食用约含 10 IU/ mL 青霉素的商品牛奶后, 发生了变态反应。在我们平常的生活中由于青霉素的大量使用使环境遭到了破坏,给人类带来了不便。催化水解青霉素β- 内酰环产生青霉噻唑酸的一类β- 内酰***酶。国际生物化学联合会( IUB ) 酶学委员会的酶编号为 。在各种微生物中分布广泛, 特别在细菌中更为广泛。由蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus 5/B 与 B. cereus 569 分别得到分子量为 35200 与 31500 的青霉素酶结晶, 从巨大芽孢杆菌 B. megaterium 提取出α,β,γ青霉素酶结晶, 随后从不同细菌又分离出多种青霉素酶。青霉素酶对热极不稳定,分解β- 内酰***的速度因青霉素与酶的种类不同而异,但对 6- 氨基青霉烷酸( 6-APA )作用却很微弱。酶反应最适 PH 值为 ~ . 以青霉素 G 钾盐为底物, Km为 × 10-3M(5/B 酶); × 10-3M(569 酶)。细菌产生青霉素酶导致出现耐药性, 临床上已分离出多种类型青霉素酶,白色粉末。分子量 50000 。溶于水。酶溶液易失活,冻干品 2~8℃可稳定一周。青霉素酶作用于青霉素的β- 内酰***环,使青霉素转变为无抗菌活性的青霉素***酸( penicilloic acid )。医疗上用于青霉素过敏症状的治疗。青霉素酶在实验中用于破坏或抑制青霉素活性β- 内酰***酶(β-lactamase ), 可水解β- 内酰***类抗生素。已发现二百多种β- 内酰-2- ***酶。青霉素酶的分类方法主要有两种,分子生物学方法和 BUSH 法。分子生物学法将酶分为四类。 A 类酶包括多种质粒编码的青霉素酶,活性部位为丝氨酸残基,分子量为 29kDa 。B 类酶为金属酶,由染色体或质粒编码,酶活性需锌离子参与, 可被乙二***四乙酸( EDTA ) 抑制。C 类酶的活性部位为丝氨酸残基, 分子量为 39kDa , 其产生与诱导剂有关。C 类酶主要指染色体编码的头孢菌素酶( AmpC 酶)。D 类酶又称为 OXA 型(水解苯唑西林) β- 内酰***酶。另一种分类方法为 BUSH 分类法,依底物及抑制剂谱不同,也将酶分为 4 类。第一类为头孢菌素酶( AmpC 酶) ,由染色体介导。第二类为青霉素酶和超广谱酶。第三类为金属酶。第四类为其它不能被克拉维酸完全抑制的青霉素酶。由于青霉素的大量使用和乱用带来的一些危害, 我们有必要来生产青霉素酶来分解青霉素,这样可以减少一些青霉素过敏反应带来的危害,也可以减少乱用青霉素带来的环境污染。这使青霉素敏感人群的安全性得到了进一步的提高,使我们的环境更加安全。青霉素 G 是目前医药工业中的最重要抗生素类产品, 具有抗菌活性强, 疗效高, 毒性低等优点, 一直是治疗敏感性细菌感染的首选药物。我国青霉素年生产能力达到 12000 吨以上, 占全球年产量的 50%, 是世界青霉素生产大国[2] 。青霉素 G 结构中的β- 内酰***环不稳定, 在酸、碱、高温、酶等作用下发生降解, 生成的物质易与蛋白或多肽结合, 生成致敏性高分子杂质, 导致过敏反应的发生[3]。青霉素过敏反应表现形式多种多样, 以过敏性休克最为严重, 常常发病迅速。其临床症状主要表现为呼吸道阻塞症状( 呼吸困难、胸闷) ; 循环衰竭( 大汗淋漓、紫绀、脉搏细弱、血压下降) ; 中枢神经系统紊乱( 意识障碍、昏迷、抽搐、大小便失禁等)。目前工业生产中大多采用溶媒萃取法从发酵液中分离青霉素 G, pH118 ~ 时用乙酸丁酯进行萃取, ~ 时用碳酸氢钠进行反萃取, 然而收率只有 80%~ 90%, 据文献报道[4], 其主要原因由青霉素 G 不稳定降解造成。医学界流行一句话: 在美国买枪很容易, 但买抗生素却很难, 而中