文档介绍：华中科技大学
博士学位论文
核壳型CdSe/ZnS量子点在生物分析中的应用
姓名:王海桥
申请学位级别:博士
专业:生物医学工程
指导教师:赵元弟
20080410
华中科技大学博士学位论文
摘要
核壳型量子点是一种新型的无机半导体纳米晶体材料。作为一种荧光标记探针,
它展现出传统荧光染料所没有的许多光化学优点。首先,量子点具有宽的激发波长,
可以方便地实现不同量子点的单波长同时激发,非常容易地实现多色应用;其次,量
子点的荧光发射峰窄而对称,能有效减少多色应用中光谱交叠问题,不需要对光谱交
叠问题进行严格的补偿;再次,量子点具有很好的光化学稳定性,经历长时间光源照
射并不损失荧光特性,而且比有机荧光染料更不容易被降解;最后,虽然不同尺寸量
子点具有不同的荧光发射波长(颜色),但是它们都具有良好方便的表面化学可修饰
性,以及表面上生物分子偶联的灵活可兼容特性(即能与生物活性分子进行有效的偶
联,如抗原抗体、蛋白、DNA 序列等)。近年来,量子点在微球光学编码、基于编
码微球的阵列分析(包括编码微球表面的 DNA 杂交分析、抗原/抗体免疫分析等)、
分子细胞成像、FRET 研究、毛细管电泳分析等众多方面都得到了广泛的应用。本论
文主要工作是研究了不同粒径量子点的有效控制合成,同时也研究了其光学、表面化
学、生物偶联等特性,并重点研究了合成的量子点作为荧光探针在生物和分析领域的
具体应用。论文完成的工作如下:
1. 采用油相合成法,通过对成核时间的控制,批量合成得到了多种不同发射波长
的量子点(500~700 nm)。对其光学性质进行了表征,发现发射波长在 590 nm 附近
时,量子点具有较好的荧光量子产率(%),而发射波长蓝移或红移时,相应的
量子点量子产率都有所降低。
2. 通过对聚苯乙烯微球进行溶涨处理、量子点的吸附装载,完成了对微球的多色
编码。我们利用量子点对微球进行了荧光编码及光谱检测,结果表明需要通过光谱分
辨才能有效鉴别不同波长与强度的编码微球。对于确定的两种量子点,通过控制掺杂
液中不同量子点浓度比率的梯度变化,可以得到信号强度比率也梯度变化的编码微
球。而且,通过微球信号强度比率和装载液中两种 QDs 摩尔浓度比率的标准曲线,可
以初步评估这两种量子点的有效编码库容量,并可用于指导微球的光谱编码。之后,
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在编码微球上固定 human IgG抗原,对溶液中相应的抗体进行了检测,结果表明,该
编码微球可以很好地检测到溶液中抗体的信号,抗体有效检测范围为 2~15 µM。这一
结果表明,该方法编码得到的微球可以被有效的用于生物学研究。
3. 介绍了一种基于量子点编码微球的流式分析技术,利用该技术对各种量子点编
码微球的荧光光谱进行了很好的区分,并实现了对溶液中特定的靶分子的有效检测。
这一检测系统是基于两个长波长的荧光信号(如黄色和红色量子点信号)来辨别确定
微球的编码,用第三个短波长的荧光信号(如绿色,染料 FITC 的信号)作为报告信
号来确定反应的发生与否,这样就可以利用量子点的荧光特性,只需一种光源就可对
编码信号和报告信号进行同时检测。实验的结果表明,该方法具有良好的准确性和重
现性。由于该系统在单光源激发下,具有快速、准确、简单、可批量实时检测等优点,
相信在得到进一步的完善后,将具有较好的应用前景。
4. 系统地介绍了脂溶性量子点水溶性修饰、量子点与生物分子偶联及其柱层析分
离纯化,以及量子点/转铁蛋白偶联物(Tf-QD)对人肝癌细胞HepG2 进行标记成像
等量子点荧光探针从制备到应用的全部过程研究。具体为,用巯基乙酸钠(sodium
thioglycolate HSCH2COONa)取代CdSe/ZnS量子点表面的TOPO,对实验室合成的脂
溶性量子点进行了有效的水溶性修饰。利用紫外、荧光和层析柱对水溶性的量子点与
转铁蛋白Tf偶联进行了表征,结果证实两者有效地偶联在了一起。之后,在对偶联物
进行分离纯化后,利用它对人肝癌HepG2 细胞进行了标记。结果表明,量子点探针
首先标记在了细胞膜上,之后在转铁蛋白(Tf)/转铁蛋白受体(TfR)介导作用下转入到
细胞内,并主要分布在细胞质部分,未能进入到细胞核内。进一步的观察发现,细胞
内的量子点荧光随时间增长在减弱,经历大约十天后再也观察不到量子点荧光。而且,
量子点并未由于本身具有的“生物毒性”而影响细胞的正常生长,10 天后细胞仍然存
活。这一工作为促进QD在生物中的应用提供了很好的借鉴作用。
5. 采用发射波长为 593 nm量子点,具体研究了luinol-H2