文档介绍：养殖技术顾问!"#$% & ! 卫生防疫酶联免疫吸附( ;>/0. )试验具有灵敏性#特异性高,且重复性好,检测速度快的特点,尤其适合于大批量血清样品的检测,是国际认可的标准化诊断方法% 我国目前广泛应用该方法进行疫病流行病学调查和免疫抗体监测,评价疫苗免疫效力% + 基本原理将抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性% 抗原或抗体再与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性%在测定时,把受检标本(测定的抗体或抗原) 和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体反应%用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开, 最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例% 加入酶反应的底物后,底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型,出现颜色反应%因此,可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应, 颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比%此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定% 由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度% 这就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性相结合,使;>/0. 方法成为既特异又敏感的检测方法% , 基本类型及用途间接;>/0. 主要用于检测抗体,双抗体法用于检测大分子抗原,双夹心法用于测定大分子抗原,液相阻断;>/0. 用于测定抗体,竞争;>/0. 用于测定小分子抗原及半抗原,抗体捕捉;>/0. 法主要用于检测/IG 抗体% - 操作方法*7! 间接酶联免疫吸附方法间接法是检测抗体比较常用的方法%主要是利用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的受检抗体, 故称为间接法% 操作步骤如下% 将特异性抗原与固相载体连接,形成固相抗原, 洗涤除去未结合的抗原及杂质% 加稀释的受检血清, 其中的特异抗体与抗原结合, 形成固相抗原抗体复合物%经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体% 其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合,在洗涤过程中被洗去%加酶标抗抗体,与固相复合物中的抗体结合,从而使该抗体间接地标记酶% 洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量% 最后加底物显色,颜色深度代表标本中受检抗体的量%酶标仪读数,对实验结果进行判定% *7" 液相阻断酶联免疫吸附方法将预先滴定好的固定量病毒抗原与被检血清首先在液相中反应,然后将抗原抗体复合物转移到包被了特异性抗体的;>/0. 板中,没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原就被;>/0. 板中的抗体捕获,于随后加入的豚鼠抗血清中的抗体结合,再通过兔抗豚鼠/I4 酶结合物和底物溶液显色% 按试验孔呈现的颜色与抗原对照孔(未加血清)呈现颜色评定结果% 抗体滴度以能阻断$)9 病毒抗原的血清稀释度来表示% 具体操作步骤如下% 用包被缓冲液稀释的病原兔抗血清稀释至工作浓度,每孔加$) 微升,摇匀后封板, # ! 过夜%兔抗血清( .‘! )吸附在固相载体上, 形成.‘!+ %抗原抗体(对照血清及待检血清)反应% 按试验要求稀释并加入对照和待检血清及抗原,封板, # "过夜%预先滴定好的固定量病毒抗原与被检血清首先在液相中反应,若被检血清中有特异性抗体,就与病毒抗原进行特异性结合% 用磷酸盐吐温缓冲( 5:0F )洗涤液洗;>/0. 板$次,在吸水纸上甩干% 将抗