文档介绍：浙江大学生命科学学院
博士学位论文
大熊猫Leptin、Ghrelin和IL-15基因的克隆表达及胃和脾脏
cDNA文库的构建
姓名:徐庆刚
申请学位级别:博士
专业:遗传学
指导教师:朱睦元
20090301
摘要大熊猫似是我国特有的国家患吨氐惚;ひ吧铮被誉为动物界的“活化石”.由于大熊猫自身的食性、繁殖能力和育幼行为的高度特化等原因,造成了大熊猫目前濒危状态,野生大熊猫现在仅存只左右。哺乳动物的繁殖和生长与营养状况密切相关,和褪墙闶场⒛芰代谢和生殖生长联系起来的关键激素。由于对大熊猫生殖力低和初生幼仔发育不良的分子机制的研究还很薄弱,对大熊猫生长发育、疾病、繁殖相关基因鏕、投甁然的克隆,对了解大熊猫生长发育规律,青春期发动,繁殖规律以及野外大熊猫的人工救助和保护具有重要的意义。大熊猫种群的规模小,遗传资源的枯竭和遗传退化都不利于种群的复壮与重建,尽快建立大熊猫的基因文库╟目庥牖蜃槲目獾不失为一种有效保存现有遗传资源的方法。本研究的目的就是克隆大熊猫投甁『裙δ芑颍并在原核和真核表达系统中实现表达;构建胃和脾脏等全长文库,为研究这些基因在大熊猫发育、繁殖中的作用及大熊猫基因资源的保存提供支持。本研究获得以下主要结果:寺×舜笮苊℅、和娜ǔけ嗦肭⒓,分别编码氨基酸的前体蛋白,成熟蛋白分别为和个氨基酸;,成熟蛋白为被帷0被嵝蛄蟹治霰砻鳎笮苊℅,与猫和狗的氨基酸序列相似性最高,%;与熊、%;.与狗、%。以上表明大熊猫三个基因在进化上可能与狗、熊和猫亲缘关系最近。和蛋白质结构模拟结果表明,大熊猫的三级结构跟人的高度相似;尽管大熊猫蛋白保守域跟人的完全相同,但三级结构与人的有较大差异。⒘舜笮苊ɑ蛟诖蟪Ω司吮泶锖徒湍刚婧吮泶锾逑担紫纫源笮猫基因进行了酵母真核分泌表达体系的建立,并系统的优化了分泌表达浙江大学博士学位论文
的条件,探索了用硫酸铵分级沉淀纯化表达产物的方法;然后采用优化的表达系统和纯化方法,实现了大熊猫和诮湍副泶锵低持懈咝П达,用亲和柱对表达蛋白的纯化。基因含有鯝,鯝,鯝;儿.,蚝个桓鯰。这些密码子都是大肠杆菌稀有密码子。在单独使用泶锵低呈保昊嵘せ崾艿揭种疲苣鸦竦帽达。本研究将质粒和騪共转化到甤辏琸和抗生素筛选,得到过表达菌株痯虰痯拐饬礁龊罅稀有密码子的基因在大肠杆菌中获得成功表达;为这三个大熊猫基因的体外表达创建了技术平台,为深入研究基因功能奠定了基础。肦椒ḿ觳饬薌在小肠、肝脏、肾脏、胸腺、脾脏和心脏组织的表达,表明大熊猫淖钪饕1泶镒橹俏福谛〕Α⒏卧和肾脏中只有较弱表达,而在胸腺、脾脏和心脏组织中没有检测到该基因的表达。另外,采用椒ḿ觳饬吮泶锏拇笮苊↖;可以作为大熊猫缺乏引起的各种疾病的防治,应用于人工繁育大熊猫。菇宋负推⒃×恢刈槁史直鸫锏ズィ焕┰×Hǔの目獾墓菇ㄎ4笮苊ㄊ承院图膊∠喙毓δ芑虻耐诰蚝脱芯刻峁┝关键词:大熊猫;基因克隆;表达;瘦素;生长素释放激素;白介素;文库构建基础。浙江大学博士学位论文
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致谢我要特别感谢导师朱睦元教授三年来的关心与栽培。本论文是在朱老师耐心细致的指导下完成的。朱老师严谨的治学态度、广博的知识视野、丰富的研究经验、勤奋忘我的敬业精神和对科学真理的不懈追求,无不给予我深刻的教诲,是我终身学习的楷模,我将终生受益。在此,谨向我的导师表示最诚挚的感谢。感谢成