文档介绍：山东大学
博士学位论文
重组组织型纤溶酶原激活剂变异体(RETEPLASE)及复性研究
姓名:赵友春
申请学位级别:博士
专业:微生物学
指导教师:张长铠;王革
20030428
疾病万人,估计每年至少有三百万人次需进行溶血栓药物治疗。血栓的形成,,简称为第三代溶血栓药物,不但生产工艺简便,在犯哂幸┪锇胨据兰疲澜缑磕晁烙桎9懿〉娜耸蛉耍夜磕晁雷涌毖9重组组织型纤溶酶原激活剂变异体案葱缘难芯摘要用质粒酶切图谱对构建的质粒进》治觯盖屑ń峁牧I杓啤>璚期长、溶栓作用强、副作用小等优势,倍暨山血管专家重视。包涵脯崧废性、复性、、药效学和对其生化特性等的硕究,获得能够临床应用的纯品。摇床培养,用诱导表达,静心培养液获菌体后取样裂解,进行分析,同时对获产科、老年病等疾病中,往往都有血机能异常或血栓形成的参与。因此,研制和生产高效的除脑匣塞、心肌梗塞、肺栓塞、弥漫性血管内凝血等,在肝脏、肾脏、内分泌代谢、外科、妇溶解血栓药物,已成为临床的迫切需求。重组人组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂缺失变异体本论文通过对戚《∞ǖ目寺。怨こ叹镅赝芎头⒔凸ひ眨员泶锏膔通过构建新型重组蛋白复性体系和探讨复性机理,实现了葱月实拇蠓忍岣撸灾导鋏推渌刈榈鞍椎墓ひ瞪哂兄匾R庖濉V饕9ぷ髂谌萑缦拢⒍詒的发酵工程、遗传学、生物化学性质等研究,将工程菌得的包涵体进行电泳,测得诱导后的菌体在分子量如附近产生了—条明显的蛋白表达带。验,返缬灸ぷR泼庖哂〖S肟箁抗体呈阳性反应,证实本产品与抗固宸⑸嗣庖叻从Γ砻鞑锉泶镎贰S肁庑蛞遣庑颍眉扑慊序,翻译成对应氨基酸序列,再经过┒撕虲末端氨基酸分析验证,确定了自主构建的鞍着巍<督峁故怯个氨基酸组成,含有个钩对二硫键,证明本试验克隆的⑷范耍瓻加こ叹姆⒔凸ひ。通过研究增加氧气溶解嗽是正确的。试
㈠馀鞍字逝ǘ扔鞍『远薪峁狗治觯醪秸鞅湫缘闹刈镮隗私燃在体外自到:和%的畹补充量达歪时,能够满足工程菌较高生长速率的要求:发酵后期补充纯氧并控制溶氧在眨苫竦媒细弑泶锫剩环⒔凸痰脑谙呖刂疲ü维持在.%;还应梯度增加葡萄糖和杵蔬蟆的数量,当钠咸烟侨芤翰钩淞看率、补充碳源、氮源等合适配比实现了菌体的富集培养:当发酵液溶氧率帕时,应以/膇酽气量补氧,并注意与搅拌速度的配合I舷匏俣,可以将溶氧率再则用调节并使其维持在—,温度控带℃。所得发酵样品进行菌体破碎,测得包涵体占总蛋白的比率泶锫为..ィ飧鼋峁哂诠谒鸮、报道的最好实验水平。⑷范藃的分离纯化工艺。选用琼脂糖偶联的赖氨酸亲和色谱和阳离子交换层析两步法,将发酵液中鞍状慷忍岣叩ヒ陨希哂诠谕庀钟兴⒍詒发酵工艺进行研究,为获得低价辅助复性蛋白提供了可能。用富氧培养法在补糖并维持在笥遥乐挂宜峄邸L砑佑衩捉蕴岣遰的表达率有帮助;通过直接控制温度诱导时间,在内由℃升温到℃,省去了加入的诱导步骤。经过分离纯化得到终产物拇慷却笥ィ寐饰疞,酶比活性为痝,高于匡内报道的结果慷寐⒊醪街っ鱌对自发正确折叠能力低的蛋白质的辅助复性效果更好。用ㄖ鞍质复性的研究是重组蛋白体外折叠研究的热点,到目前为止,大多局限在墓δ芊治龊对部分蛋白复性率提高的机理探索上,尚无研究二硫键数量与ㄖ鄣叵档谋ǖ溃文发昵鸯组蛋白所含二硫键数量与ㄖ葱缘男Ч蛋白结构正确折叠芮邢喙兀二硫键愈多的重组蛋白,其自发正确折叠能力则愈低。⑾止谕庋芯縋辅助复性蛋白质含二硫键最多的是裕韭畚难芯康母葱缘鞍缀远蚣虼吮韭畚氖鞘状谓玶用在含二硫键最多的工程菌重组蛋白的辅助复性研究。平。騡几;痝
的浓度比。在本试验剁拢Χǘ缺任猯/时复性率最高。在生产中选用哪Χ臼匝槭褂玫母葱怨ひ帐莚辅助复性,复性率稳定在以上。,体外复性需要分子伴侣和折叠酶的帮助。本论文首次将咖,τ糜诖俳鴐葱怨ひ盏难芯浚ü詒的重组ㄖ葱缘率、复『生蘧率、蛋白质浓度、圆二色分析等试验,初步证明其作用机理是分子伴侣和折叠酶双重作用。通过对复性体系的对比研究,证实葱蕴逑到螱:复性体系能够显著提高的复性率和鞍着ǘ取⒀芯吭谑笛槭液椭惺蕴跫掠跋靣辅助复性的工艺技术条件,包括温度、、蛋白质浓度、褂昧俊⒏葱砸号浞降龋阎な担ㄖ鷕复性需要合适度最经济,虽然酶活仅比前者低,:通过复性时间对蛋白质折叠影喻试验,,本臼匝榉掷氪炕际醪捎玫氖荓亲和层析,亲和介质的稳定性优于公司的蛋白抑皋好剐亲和层析介质:是谷胱甘肽还原法,需要用大量的谷胱甘肽,造成必须使用特制大型高压超滤容器。臼匝榈母葱蕴逑礽譼簉的蛋白浓度为/,容易放大生产规模。世界匕现有的复性体系只允许/,得率明显偏低。⒀芯