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实验五黑曲霉发酵生产柠檬酸
柠檬酸（citric acid） 又名枸橼酸，学名 2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid）
2-羟基丙烷-I ， 2， 3-三羧酸（2 一 hydroxy propane-1 ， 2，3 — triearboxylic acid） 。商品柠檬酸 有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为 C6H8O7 •H2O,相对分子
。另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为 GHO,相对分子质量
。柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、
医药、化工、化妆品、清洗 （洗涤）、建筑等工业部门。其中食品和饮料业占 56%，清洗（洗涤剂）业
占20 %，医药和化妆品占11%，其他工业占13%。
1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。 .1893年后发现微生物可产生柠
檬酸，1951年美国Miles公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在 20世纪40年代初期开始浅盘
发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。
能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能
够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。最具商业竞争优势的是采用黑曲霉、文氏曲霉和解脂假
丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。
本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体 （摇瓶）发酵产生柠檬酸。柠檬酸
发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。将获得柠檬
酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液， 粗制柠檬酸液再经活性炭脱色、
离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典 BP- 98版标准
的无水或一水柠檬酸。
一、 实验目的
了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及中间分析方法。
二、 实验原理
黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将
薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过糖酵解途径（ EMP和HMP途径转变为***酸；
***酸由***酸氧化酶氧化生成乙酸和 CO，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶 A,然后在柠檬酸合成酶
（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度
葡萄糖和充分供氧的条件下， TCA循环中的a —***戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA循环变成“马蹄形”，
代谢流汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为：
C6H12O + C6HO+2H2O
%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为 %。
三、实验装置与流程
（1） 实验装置与材料：
① 实验装置：旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机 （4000〜6500r / min）。
② 菌种：黑曲霉柠檬酸生产菌株 CO8-