文档介绍：实验九总糖和还原糖的测定(二) ── 3,5 -二硝基水杨酸法一、目的要求: 掌握还原糖和总糖的测定原理,学****用比色法测定还原糖的方法。二、实验原理: 在 NaOH 和丙三醇存在下, 3,5 -二硝基水杨酸( DNS ) 与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的 NaOH 碱性溶液中此化合物呈桔红色,在 540nm 波长处有最大吸收, 在一定的浓度范围内, 还原糖的量与光吸收值呈线性关系,利用比色法可测定样品中的含糖量。 HOOC NO OH NO 22 + 还原糖 NO OH NH 22 (DNS) (3 -氨基- 5 -硝基水杨酸) HOOC 黄色桔红色三、试剂和器材 1 、试剂(1)1 mg/ml 葡萄糖标准溶液: 准确称取干燥恒重的葡萄糖 1 00mg ,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至 100ml ,即含葡萄糖为 1 .0mg/ml 。(2) 3,5 —二硝基水杨酸试剂: 称取 g 3,5 —二硝基水杨酸并量取 262 ml 2mol/L NaOH 加到酒石酸钾纳的热溶液中( 182 g 酒石酸钾纳溶于 500 ml水中),再加 5g结晶酚和 5g亚硫酸氢钠溶于其中,搅拌溶解,冷却后定容到 1000 ml贮于棕色瓶中。(3 )碘-碘化钾溶液:称取 5g 碘, 10g 碘化钾溶于 100ml 蒸馏水中。(4) 6N NaOH :称取 120g NaOH 溶于 500ml 蒸馏水中。(5) % 酚酞指示剂。(6) 6 mol/L HCl 溶液 2 、材料小麦淀粉或玉米淀粉。 3 、器材分光光度计,天平,水浴锅,电炉,试管若干等。四、操作方法 1、葡萄糖标准曲线制作取8支 15mm × 180mm 试管,按下表加入 1 .0mg/ml 葡萄糖标准液和蒸馏水。试剂管号 012345678 葡萄糖标准液(ml) 0 蒸馏水(ml) 水杨酸溶液(ml) 葡萄糖含量(mg) 0 将各管溶液混合均匀,在沸水中加热 5 min ,取出后立即用冷水冷却到室温, 再向每管加入 ml蒸馏水,摇匀。λ=540 nm 处测定吸光度以葡萄糖含量( mg )为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。 2 、样品中还原糖的提取准确称取小麦(淀)粉,放在 100ml 烧杯中,先以少量蒸馏水(约2 ml) 调成糊状,然后加入 40m l 蒸馏水, 混匀,于 50℃恒温水浴中保温 20min , 不时搅拌, 使还原糖浸出混。过滤, 将滤液全部收集在 50m l 的容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,即为还原糖提取液。 3 、样品总糖的水解及提取准确称取小麦(淀) 粉,放在锥形瓶中,加入 6mol/L HCl 10ml ,蒸馏水 15ml ,在沸水浴中加热