文档介绍：碱性磷酸酶km值测定实验报告

篇一：酶促反应动力学实验报告
酶促反应动力学实验报告
********** 杨恩原
实验目的：
1. 观察底物浓度对酶促反应速度的影响
2. 观察抑制剂对酶促反应速度的影响
3. 掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值
实验原理：
一、底物浓度对酶促反应速度的影响
在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[S]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(Michaelis-Menten方程)即：
式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度
当v=Vmax/2时，则Km=[S]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-Burk方程)，则此方程为直角方程，即:
以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。将各点连线，在横轴截
距为-1/Km，据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[S]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响
凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。本实验选取Na2HPO4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。实验步骤：
实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响
1. 取试管9支，：
管号
试剂
2. 另取9支试管编号，做酶促反应：
管号
试剂
3. 混匀，37 ℃水浴保温5分钟左右。
4. 加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 ℃准确保温15分钟。
5. 保温结束， NaOH ml 以中止反应。% 4-氨基安替
％铁氰化钾 ml。
6. 充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色。读取各管吸光度，
做记录。(酶活性计算及Km值计算)
实验计算：
1. 在37°C下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（ug），
以此计算处各管的酶活性（v）。
2. 以1/v为纵坐标、1/S为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值。
Y=+, Km=
实验二:抑制剂对酶促反映的影响
1. 取试管9支，：
管号
试剂
2. 另取试管9支，做酶促反应：
管号
试剂
3. 混匀，37 ℃水浴保温5分钟左右。
4. 加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 ℃准确保温15分钟。
5. 保温结束， NaOH ml 以中止反应。% 4-氨基安替
％铁氰化钾 ml。
6. 充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510 nm处比色。读取各管吸光度，
并计算各管酶活性。
实验计算：
以酶活性单位(v)的倒数1/v为纵坐标，以底物浓度[S]的倒数1/S为横坐标，在方格纸上描点，并连接各点，求该酶的Km值并与前面未加入抑制剂时测出的Km值作比较。
Y=+, Km=
实验分析：
通过绘图及分别计算无抑制剂与有抑制剂时酶的Km值，可发现，此抑制剂为竞争性抑制剂。通过绘图发现，其两条以1/v为纵坐标、1/S为横坐标的直线截距几乎相同，而加入抑制剂后，酶的Km值更大，此为竞争性抑制剂的特征：Vmax不变，Km变大。
思考题
一、除了双倒数作图外，你能举出其它能将酶动力学数据做出直线图的方法吗？
1. 海涅斯-沃尔弗作图法（Hanes-Wolff plot）
双倒数方程式两边同时乘以[S]
直线的斜率等于1/Vmax，横轴截距为-Km
2. 伊迪-霍夫斯蒂作图法（Eadie-Hofstee plot）
米氏方程式两边均除以[S]
直线的斜