文档介绍：实 验 三 贴壁细胞培养
1
精选ppt课件最新
用倒置显微镜观察细胞，评估细胞(喉癌)生长状态以及确认无细菌和真菌污染。弃旧培养液：吸除或倒掉培养皿中的旧培养基。
2) 漂洗：每个培养皿加1mL PBS清洗单层细胞，漂洗贴壁细胞一次后倒掉。
细胞培养方法
2
精选ppt课件最新
消化：每个dish加入1mL消化液
（%:1），轻轻摇动培养皿，经消化液铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下待1/2细胞变圆后加适量完全培养液终止。
3
精选ppt课件最新
离心：1000rpm、5分钟离心沉淀细胞，去除培养基（含胰酶及EDTA）。
5) 计数：离心前先滴好计数板待计数，计算细胞的浓度（个/ml）。
取对数生长期于10cm ×105/孔（5×105/孔）密度铺于6孔板，再用完全培养液补至2 ml/孔。
4
精选ppt课件最新
实验四 流式细胞仪检测贴壁细胞凋亡
2015-5-20
5
精选ppt课件最新
实验原理
细胞凋亡检测试剂盒（Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit）是一种采用经典的碘化丙啶染色（PI staining）方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种可以嵌合到双链DNA和RNA的碱基对中并与之结合的荧光染料，无碱基特异性。碘化丙啶与双链DNA结合后可产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被Propidium Iodide染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡的分析。
6
精选ppt课件最新
实验材料
胰蛋白酶消化液(% EDTA)
PBS缓冲液
预冷固定液（4％多聚甲醛）
流式细胞仪
7
精选ppt课件最新
操作步骤
细胞样品的制备（6孔板贴壁细胞）
1、PBS清洗细胞,用1ml胰蛋白酶消化细胞(10min)至可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入1ml细胞培养液终止反应，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞；
2、收集上述细胞悬液至15ml离心管；
3、4℃，1000rpm 离心5min，弃上清；
4、加入1mlPBS缓冲液，重悬细胞，；
5、重复步骤 3、4；轻弹离心管底以适当分散细胞。
8
精选ppt课件最新
细胞固定
加入1ml冰浴预冷的4%多聚甲醛中，轻轻吹打混匀，4℃条件下固定2h或更长时间。
细胞清洗
1、4℃，1000rpm离心5min，弃上清；
2、加入1mlPBS缓冲液，重悬细胞，；
3、重复步骤1、2；
4、轻弹离心管底以适当分散细胞。
操作步骤
9
精选ppt课件最新
操作步骤
PI染色 (一步法)
PI染色工作液配制: 根据待测样品的数量,取适量的试剂A ,试剂B ,试剂C 混合形成PI染色工作液(见实验方案表).
在每个待测细胞样品中,加入500ul配制好的PI染色工作液,轻轻重悬细胞沉淀,置于37度避光水浴30min.
10
精选ppt课件最新