文档介绍：天津医科大学
博士学位论文
人DAF、CD59基因特异表达载体的构建及其在猪血管内皮细胞表
达的研究
姓名:姚旭东
申请学位级别:博士
专业:泌尿外科
指导教师:马滕骧
摘要将建立在皂笪囱座缉地特异表达人双补/猪对人的异种器官移植被认为是解决同种移植长期器官短缺的一种方法。、人体内存在针对远缘动物细胞表面多糖分子的天然抗体,此类抗体结合特异性高表达的转基因很难达到;另外,在许多实践研究中,转基因胞中选择特异性高表达的启动子,也就成为异种移植转基因研究的重要内容虻奶匾毂泶镌靥澹约霸谥硌9苣谄は赴检测重组基因的表达,是建立此转基因猪的上游工作。我们课题组业己完成的工作:①从人②类似上述的方法,构建了人一髌动子的虮泶镌靥錺籌一籇。③分别构建了检测一舳踊钚约鞍诤悠卧谀诘钠舳踊钚缘穆躺ü抗原在移植物血管内皮激活补体系统和凝血系统引发超急性排斥反应且熘制鞴僖浦渤晒Φ淖畲笳习一些表达人补体调节蛋白如虲淖;蛑砑罕唤ⅲ这些转基因猪可以辽偈遣糠值刷受人天然抗体结合物激活补体后的袭击。然而,也许是内皮细胞固有的异质性,在整个成年供体动物血管树中,的普遍表达将有可能与拗生理不协调~致,甚或对宿主有害,生物学家由此要限制转基因在特异细胞,如内皮细胞中表达。因此,在内皮细之一。人细胞间粘附分子一启动子是近年来研究较多的一内皮细胞的特异启动子,能够在体内、外驱动外源基因在血管内皮细胞高表达。另外,更多的研究还表明排斥反应能力。基于目前研究观点动物较单基因动物显示了更强的抗超急体调节蛋白虳淖;蛑怼9菇ㄐ腥薎启动子的、谆蜃橹锌寺×薣启动子片段,克隆了基因第一内含子起增强子作用的危牍饣菰腃蛑刈椋菇表达载体及不含增强子蛋白报告基因。④培养并鉴定猪血管内皮细胞,培养猪耳成纤维细胞。用脂籆泶镌靥濉····!天津医科人学博上学位论文●●猒●R
破的功能情况。髡咴诖丝翁庵校嘀赝瓿梢韵鹿ぷ骷把芯俊质体包裹质粒转染方法,将上述表达载体及报告基因分别转染猪血管内皮细胞及成纤维细胞。⑤通过荧光显微镜检测报告基因的表达:通过流式细胞仪,。⑥筛选、克隆表达鞍椎腜糜牒H搜G錗方法根据文献。,经电泳分离、切胶回收纯化得到不含病毒启结果得到一—瓹泶镌靥澹訣消化此重组质粒,瓺基因特异表达载体的重建对表达载体在兴彩北泶锝辛思觳猓和ü魇较赴呛蚏甈共孵育方法,检测乳酸脱氢酶漏出率,评价表达鞍譖谷搜G迦基因特异表达载体的构建利用椒ù尤搜;蜃槔┰龅玫絀启动子、基因的一段增强子片段,经电泳分离、切胶回收纯化得到上述片段,分别双酶/单酶姓饬教跗危炕厥毡赣茫凰盖动子、含筛选基因囊欢蝡籆魑T靥逍蛄校籌启动子片段先与载体进行连接反应后转化细菌,#涸俚ッ切此质粒,纯化该载体与增强子片段连接,转化细菌、抽提质粒。,,上述结果完全符合设计要求:对插入子分别进行测序,结果符合基因库..瓹菇ɑ竦贸晒Α方法双酶切本室己将一舳佑隓重组的原核质粒一玫胶薎启动子及刃蛄械牟迦肫两片段,以疜盖兄柿J保鱿諳..、跗序列。、天津医科大学博宦畚\
.;双酶切真核表达载体,得到不含病毒启动子、含筛选基含人一舳拥腄重组基因表达载体硌9苣谄は赴脑嘌⒓ḿ疤匾毂泶镌靥遄H方法以胰酶消化和刀刮血管内膜相结合的方法,用含.%胎牛血清泶镌靥逶谥硌9苣谄は赴谋泶锛觳.%。.;两段辛臃从笞;细菌;阳性转化菌落质粒抽提及酶切鉴定。。结果特异性三组酶切重组表达载体,产生符合设计的相应条带;┰,与设计要求一致。结论E嘌⒃硌9苣谄は赴灰缘怪孟晕⒕岛屯干涞缇检查确定为内皮细胞。筛选街苌彼滥谄は赴畹团ǘ任蝩利用脂质体包裹质粒姆椒ń鲜龉菇ǖ腃特异表达载体转染猪血管内皮细胞,抗生素筛选转染刈榛虻哪谄は赴⒃倥养克隆。结果成功地培养了猪血管内皮细胞;成功地转染、,借助流式细胞仪对瞬时转染基因的猪血管内皮细胞、抗转虻闹硌9苣谄は赴蠧鞍住蛋白检测;,对稳定表达鞍椎闹硌9苣谄は赴凶躌提取,—从觳釪的表达情况。结果正常猪血管内皮细胞不表达人鞍祝胍跣远哉湛固逑啾较,阳性表达率不足ィ灰匀撕煜赴魑Q粜远哉眨珿秆⒖寺∽
论和技术基础。弧⒁段;体外以猪血管内皮细胞为研究对象模拟异种移植排斥现象,以及利用其染细胞在阳性区间且荧光强度较高。遗憾的是,转染带有增强子的籆赴可伲泶锴卟荒