文档介绍：酶联免疫吸附实验
研究生实验: 酶联免疫吸附实验
第一部分: 基本实验原理
基本原理
先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原进行反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分，然后加入酶的作用底物催化显色，进行抗原或抗体的定性或定量检测。
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研究生实验: 酶联免疫吸附实验
第二部分: 常用实验方法
一、间接法
此法常用于测抗体。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物显色进行测定（图1）。
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研究生实验: 酶联免疫吸附实验
图1: 间接法测抗体示意图
固相抗原
待测标本(含相应抗体)
酶标抗抗体
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第二部分: 常用实验方法
二、双抗体夹心法
此法常用于测抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合，温育洗涤后，加入酶标抗体和底物显色进行测定（图2）。
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图2: 双抗体夹心法测抗原示意图
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第二部分: 常用实验方法
三、竞争法
此法常用于测抗原和半抗原，也用于测抗体。以测抗原为例，将特异抗体吸附于固相载体，加入待测抗原和酶标已知抗原，使两者竞争与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关，即待测抗原和酶标抗原颜色反应的差数是待测抗原的含量（图3）。
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研究生实验: 酶联免疫吸附实验
图3: 竞争法测抗原示意图
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研究生实验: 酶联免疫吸附实验
第三部分: 方法的特点和进展
ELISA方法由于灵敏、特异，操作简便、快速，实验设备要求较为简单，应用范围广泛，无放射性污染等优点，成为目前普及应用最广，发展最快的免疫学技术之一。生物素-亲合素系统（BAS）是在ELISA中应用的常见技术（BAS-ELISA），其中ABC- ELISA法更为常用，其基本原理为，固相抗体+待测抗原+生物素化抗体+亲合素-酶标生物素复合物+底物显色。
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: 人TNF-α检测实验原理
基本实验原理:
双抗体夹心ABC-ELISA法。抗人TNF-α单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的人TNF-α会与单抗结合，游离的成分被洗去。同时加入生物素化的抗人TNF-α抗体和辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合；抗人TNF-α抗体与结合在单抗上的人TNF-α结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色剂，若反应孔中有人TNF-α，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测A值，人TNF-α浓度与A450值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中人TNF-α浓度。
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