文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
肝再生增强因子的重组表达及其抗肝纤维化作用研究
姓名:熊伍军
申请学位级别:博士
专业:内科学、消化病学
指导教师:邱德凯

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肝再生增强因子的重组表达及其杭肝纤维化作用研究
博士研究生熊伍军
油,勺
导师卑德凯教授
中文摘要
背景目的慢性肝炎是严重危害我国人们健康的一种常见疾病,大部分慢性
肝炎者可发展为肝纤维化、肝硬化,目前尚无确切有效的治疗方法。近年研究表
明肝纤维化的发生、发展与肝细胞再生过程密切相关,调控肝细胞的再生是肝纤维
化防治的一条新的重要途径。肝再生增强因子是新近发现的一种促进肝细
胞再生的重要生长因子,天然主要是通过将来源于断乳哺乳动物肝脏或部分肝
切除后再生肝脏的肝刺激因子促肝细胞生长因子经过乙醇沉淀、
超滤、层析、聚丙烯酞胺凝胶电泳等过程纯化而得到,其制备过程复杂、得率低、
成本高,限制了对生物学活性及其应用研究。年克隆的完成
使通过基因过程方法制备大量重组成为可能课题首先观察了
在慢性肝炎、肝纤维化中的作用,为利用抗肝纤维化提供部分理论依据然后
通过构建大鼠原核表达质粒,诱导在大肠杆菌中表达,制备并纯化了大
量的,初步观察在肝纤维化防治中的作用,探讨其可能作用机制,以期
为肝纤维化的防治提供一条新的可能途径及新的可能作用因子。
沙’·通过建立四氯化碳,肝纤维化动物模型,于体内观察了
对玩肝纤维化动物模型大鼠肝功能、血清肝纤维化指标及肝脏组织纤维化程度分
级的影响并于临床收集慢性乙型肝炎患者例,观察了对慢性乙型肝炎患
者肝功能、血清肝纤维化指标的影响。按文献报道的大鼠核昔酸序列设计
合成引物,利用抽提试剂盒从乳鼠肝组织中提取,经扩增出
的片段,并克隆入质粒,酶切鉴定阳性克隆,阳性克隆扩增并
进行核昔酸序列测定。将克隆质粒、原核表达质粒
分别经酶切,回收酶切片段,回收酶切片段在几连接酶的作
用下构建原核表达质粒,转导大肠杆菌,鉴定阳性克隆,阳性表达质
井于,不生增强因子的组衰达及其主七月于纤维化作用研究
粒进行核普酸序列分析,阳性表达菌用诱导表达,经聚丙烯酞胺凝
胶电泳纯化并鉴定。通过胶原酶链蛋白酶灌注梯密度离心分离
大鼠肝星状细胞,用紫外线照射诱导发生突变,利用有限稀释法获得
克隆,并逐步扩增建立细胞株。于体外用酸性磷酸酶法观察了对大鼠
细胞株和成纤维细胞株增殖的影响,用放免法及法测定其培养上
清中细胞外基质水平,观察对其细胞外基质合成的影响。通过建立
肝纤维化动物模型,观察对肝纤维化动物模型肝功能、血清细胞外基质水平
及肝组织纤维化程度的影响。
结果可显著改善实验性肝纤维化及慢性乙型肝炎患者肝功能、降低
血清肝纤维化指标水平及肝组织纤维化程度分级,可用于慢性肝炎肝纤维化的防治,
为利用抗肝纤维化提供了部分理论依据。大鼠完整地插入了
一质粒,核昔酸序列分析表明插入的核昔酸序列与文献报道的大
鼠核昔酸序列完全一致。成功地构建了原核表达质粒
,核昔酸序列分析表明完整地插入了多克隆位点,
其阅读框正确,经诱导、纯化得到大量。成功建立了细胞株,为体外
筛选抗肝纤维化作用药物提供了方便的细胞模型。体外观察发现可抑制
细胞株的增殖及其细胞外基质的合成,而对大鼠成纤维细胞株的增殖及细胞
外基质的合成无明显影响。可显著改善玩肝纤维化模型大鼠肝功能,
低血清细胞外基质水平,降低肝组织纤维化程度,具有显著的抗肝纤维化作用。
结论可用于慢性肝炎肝纤维化的防治,为利用抗肝纤维化提供了
部分理论依据。通过基因工程重组技术成功构建了大鼠高效原核表达质
粒,并在大肠杆菌一中获得成功表达,所得重组蛋白经复性后,
于体外实验证明可抑制肝星状细胞株的增殖及细胞外基质的合成,于体内实
验证明可改善肝纤维化模型大鼠肝功能、降低血清细胞外基质水平、降
低肝组织纤维化程度,具有显著的抗肝纤维化作用。本课题的完成为肝纤维化的防
治提一条新的可能途径及缨子· , ‘
关键词肝再生增强因子重组易肝纤维化服姗缎扩霭性肝
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