文档介绍：分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
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分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
第一节基因操作概述 2
一、聚合酶链式反响(PCR) 2
二、质粒概述 4
三、凝胶电泳 5
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 6
五、重组质粒的连接 7
六、限制性内切酶消化 7
七、SDS-PAGE蛋白质电泳 7
第二节材料、设备及试剂 7
一、材料 8
二、设备 8
三、试剂： 9
第三节操作步骤 10
一、目的基因的获得： 10
二、pET-21bT〔pET-21bR、pET-21b〕载体的获得： 11
三、pET-21b等与目的片段的连接作用 12
四、转化大肠杆菌DH5α进展阳性克隆子筛选与鉴定 13
五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进展SDS-PAGE电泳。 14
六、融合蛋白的毒力测定 16
第四节本实验的实验报告 16
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第一节基因操作概述
一、聚合酶链式反响(PCR)
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反响)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个根本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DN***段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进展合成。由这三个根本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。
　　〔一〕、PCR反响中的主要成份
　　1、引物：PCR反响产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循以下原那么：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长那么比拟浪费，且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%～60%，可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)。(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对。(6)两引物之间尤其在3'端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。(7)引物5'端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、***等。通常应在5'端限制酶位点外再加1～2个保护碱基。(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。～ L /L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低那么降低产量。
　　2、4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5～10mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反响中每种dNTP的终浓度为20～200μmol/L。
3、Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+～2mmol/L。对于一种新的PCR反响，～5mmol/L的递增浓度的Mg2+进展预备实验，选出最适的Mg2+浓度。
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