文档介绍：RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq 的应用领域
RNA-Seq 面临的挑战及发展前景
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RNA-Seq 的技术背景
RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptome sequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）
原则上, 所有的高通量测序技术都能进行RNA测序。自2005年以来, 以Roche 公司的454 技术、Illumina 公司的Solexa 技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测序技术相继诞生, 之后HelicosBiosciences 公司又推出单分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术。新一代测序又称作深度测序或高通量测序, 是相对于传统的Sanger 测序而言,主要特点是测序通量高, 测序时间和成本显著下降。各平台测序原理及序列长度的差异决定了各种高通量测序仪具有不同的应用侧重
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转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA 的集合
转录组？
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RNA-Seq 原理
把高通量测序技术应用到由mRNA 逆转录生成的cDNA 上, 从而获得来自不同基因的mRNA 片段在特定样本中的含量, 这就是mRNA 测序或 mRNA-Seq, 同样原理, 各种类型的转录本都可以用深度测序技术进行高通量检测, 统称作RNA-Seq
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Total RNA
Rich mRNA
(polyA RNA)
Fragmentation
(200~700 bp)
Oligo(dT) primed
cDNA synthesis
Paired-end
Solexa Sequencing
Random hexamer primed
cDNA synthesis
RNA fragment
(200~700 nt)
Random hexamer primed
cDNA synthesis
Procedure of RNA-Seq
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1. 样品RNA准备
2. 测序文库构建
􀂾 使用oligo dT微珠纯化mRNA
􀂾 mRN***段化处理
􀂾 反转录反应合成合成双链cDNA
􀂾 双链DNA末端修复及3’末端加‘A’
􀂾 使用特定的测序接头连接DN***段两端
􀂾 高保真聚合酶扩增构建成功的测序文库
3. DNA成簇（Cluster）扩增
4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx）
5. 数据分析
􀂾 原始数据读取
􀂾 与数据库比对并进行注释
􀂾 深层次数据分析
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RNA-Seq 的应用领域
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图所示 RNA-seq获得的数据能够进行全面的数据挖掘，既能够进行基因结构分析，鉴定UTR、可变剪切位点，也能够发现新的转录本及非编码RNA，比较样本间的表达水平差异
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RNA-Seq 面临的挑战
庞大的数据量所带来的信息学难题
如何针对更复杂的转录组来识别和追踪所有基因中罕见RNA 亚型的表达变化
目前的高通量测序技术大都需要较多的样品起始量, 这使得来源极为有限的生物样品分析受到限制, 因此如何对单细胞或少量细胞进行转录组测序是一个亟待解决的问题
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RNA-seq常见问题
送样要求：
浓度≥400ng/ul，RNA总量≥20ug；OD260/-，28S/18S＞，RIN ≥8.
在进行原核生物转录组分析时需要提供纯化后的原核生物mRNA或cDNA样品。
进行非编码RNA测序时需要提供去除rRNA和tRNA的RNA样品。
测序1Gb的转录组数据时通常可以得到长度大于500bp的Unigene12000个以上，但转录组大小受基因数目和基因丰度双重影响，组织差异、状态和实验处理也会影响转录组组成。
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