文档介绍：- -
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总RNA的提取〔Trizol法提取〕
在收集到生物材料之后，最好能即刻进展RNA制备工作。假设需暂时储存，那么应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以参加液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以防止RNase的作用。
提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进展裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；
在上述EP管中，按照每1ml ，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下〔15℃～30℃〕放置2～3分钟后，12000g〔2℃～8℃〕离心15分钟；
取上层水相置于新EP管中,按照每1ml ，在室温下〔15℃～30℃〕放置10分钟,12000g〔2℃～8℃〕离心10分钟；
弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进展洗涤，涡旋混合，7500g〔2℃～8℃〕离心5分钟，弃上清；
让沉淀的RNA在室温下自然枯燥；
用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
PCR
实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱廉价，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A〞碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进展基因的扩增请使用此酶。
按以下组成在PCR反响管中调制反响液：
TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方
Reagent
Quantity, for 50µl of reaction mixture
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10X PCR buffer 〔Mg2+ free〕
5 µl
MgCl2〔25mM〕
如TaKaRa TaqTM加3 µl
如TaKaRa EXTaqTM加4 µl
dNTP mix
4 µl
10µM Primer 上游
1 µl
10µM Primer下游
1 µl
Template DNA
1 µl
Taq或EXTaqDNA Polymerase
µl
Sterile deionized water
Up to 50µl
Total
50 µl /Sample
PyrobestTM DNA Polymerase的配方
Reagent
Quantity, for 50µl of reaction mixture
10X Pyrobest buffer
5µl
dNTP mix
4µl
10µM Primer上游
1µl
10µM Primer 下游
1µl