文档介绍：目录 Y2344900 摘要??????????????.?.????..1 一、实验材料和方法????????????????10 二、实验结果与分析????????????????28 三、讨论?????????..?????????..36 小结????????????????????39 展望????????????????????40 参考文献????????..??????????..41 附录????????.??????????.?.45 研究生简历????????...????????.....55 致谢????????????????????56 独创性声明??????????????????..57 中国医学科学院/北京协和医学院硕士研究生学位论文摘要手足口病(Hand,foot andmouthdisease,HFⅧ)是由多种肠道病毒引起的常见传染病。近几年来,手足口病在亚太地区呈上升趋势,成为危害婴幼儿健康的重要传染病。肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是HFMD最重要的病原体,柯萨奇A16型(Coxsackies A16,CAl6)也在HFMD中占有一定的比例,目前EV71和CAl6是我国近几年流行的两种重要病原体。由EV71感染引起的手足口病临床表现为手足口部位出现皮疹或疱疹、溃疡等,在婴幼儿常会伴有严重的神经性并发症,包括病毒性脑膜炎、脑炎以及脊髓灰质炎样麻痹,引起的肺水肿、肺出血常导致婴幼儿死亡。迄今为止尚无特效抗病毒药物问世,疫苗将成为预防控制手足口病流行最有效的手段之一。疫苗的研制包括减毒活疫苗、灭活疫苗及基因工程疫苗,这些疫苗各有特点,本文重点研究了杆状病毒作为表达系统表达EV71主要抗原基因形成类病毒颗粒及其免疫效果。在新型疫苗中,亚单位疫苗以类病毒颗粒( Particles,VLPs)较为理想,因其由病毒外壳蛋白所组成,构象上最接近天然病毒颗粒,具有较好的免疫原性,且不含病毒基因组成分,安全性较高,这些优点使类病毒颗粒疫苗成为基因工程疫苗研究的热点。杆状病毒表达系统(baculovirus expression system, BES)是一个以昆虫杆状病毒为外源基因载体,以昆虫细胞为受体的真核表达体系。因其可以容纳大片段外源基因进行表达,使其在疫苗研究中更具有优势,也由于是在真核系统中表达,杆状病毒表达系统被认为是表达类病毒颗粒的最佳表达系统之一。目的:利用流行地区分离到的EV71毒株,,并对类病毒颗粒的免疫原性做了初步评价。方法:,,与杆状病毒质粒Bacmid进行同源重组,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,,将重组杆粒通过脂质体转染法转染昆虫细胞sf9细胞系,获得携带EV71病毒结构基因P1和3CD 蛋白酶基因的重组杆状病毒rBV-,并通过蚀斑的方法对重组杆状病毒的滴度进行了测定。采用免疫荧光、Westem Blot及电镜观察等方法检测重组病毒中国医学科学院/北京协和医学院硕士研究生学位论文表达产物特异性及形态学特征。表达产物经蔗糖密度梯度离心纯化,纯化后的目的蛋白经电镜、WesternBlot鉴定后免疫BALB/c小鼠,用ELISA、微量中和试验的方法对其免疫效果进行初步评价。结果:,间接免疫荧光表明重组杆状病毒rBV-,Western Blot结果可见分子量约为39KD,条带符合VPl分子量,证明P1基因可被表达的3CD酶正确切割。电镜结果可观察到大小约为 ,ELISA法检测到实验组小鼠血清中抗EV71特异性IgG抗体,效价为1:776,微量中和实验显示,血清能中和EV71病毒,中和效价为1:588。结论:,经3CD正确切割P1,在sf9细胞中组装形成EV71类病毒颗粒。经动物实验初步评价,该类病毒颗粒能够诱导实验小鼠产生特异性抗EV71抗体, 具有较好的免疫原性。这项研究获得的结果为EV71新型疫苗的研发提供了依据和参考。关键词:手足口病;EV71;类病毒颗粒;; 免疫评价中国医学科学院/北京协和医学院硕士研究生学位论文 Exi ofEnter●"is~?P inBaculo