文档介绍：1 蛋白质含量测定法 2 WESTERN PROTOCOL 3 Western 免疫印迹( Western Blot ) 4 蛋白质沉淀法 5 蛋白质提取的方法总汇 1 蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法, 是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法( Biuret 法)、 Folin -酚试剂法( Lowry 法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法, 即考马斯亮蓝法( Bradford 法)。其中 Bradford 法和 Lowry 法灵敏度最高, 比紫外吸收法灵敏 10~ 20倍,比 Biuret 法灵敏 100 倍以上。定氮法虽然比较复杂, 但较准确, 往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是, 这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质, 因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质; ③溶液中存在的干扰物质; ④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法( Bradford 法) ,由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏( Kjeldahl )定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨, 借蒸汽将氨蒸至酸液中, 根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: CH2COOH |+ 3H2SO4 ? 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1) NH2 2NH3 + H2SO4 ? (NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4 + 2NaOH ? 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3) 反应( 1)、(2) 在凯氏瓶内完成,反应( 3 )在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化, 可以加入 CuSO4 作催化剂, K2SO4 以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以 6. 25 即得。五种蛋白质测定方法比较如下: 方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法( Kjedahl 法) 灵敏度低, 适用于 ~ 氮, 误差为±2% 费时 8~ 10 小时将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定非蛋白氮(可用三***乙酸沉淀蛋白质而分离)用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长双缩脲法( Biuret 法)灵敏度低 1~ 20mg 中速 20~30 分钟多肽键+碱性 Cu2 +? 紫色络合物硫酸铵; Tris 缓冲液; 某些氨基酸用于快速测定, 但不太灵敏; 不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏 50~ 100mg 快速 5~10 分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在 280n m 处的光吸收各种嘌吟和嘧啶;各种核苷酸用于层析柱流出液的检测;核酸的吸收可以校正 Folin -酚试剂法( Lowry 法) 灵敏度高~ 5mg 慢速 40~ 60 分钟双缩脲反