文档介绍：PCR 引物设计引物设计的原则?首先引物要跟模板紧密结合; ?其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在; ?最后引物不能在别的非目的位点引起高效DNA 聚合反应(即错配)。围绕这几条基本原则,设计引物需要考虑诸多因素,如: ?引物长度( primer length ), ?产物长度( product length ), ?序列 Tm 值(melting temperature) , ?ΔG值(internal stability) , ?引物二聚体及发夹结构( duplex formation and hairpin ), ?错误引发位点( false priming site ), ?引物及产物 GC 含量( composition ),有时还要对引物进行修饰,如增加限制酶切点,引进突变等。引物设计需要考虑的因素引物设计要点?一般引物的长度为 16-23bp ,常用的长度为 18-21bp , 过长或过短都不合适。?引物 3’端的碱基一般不用 A ,因为 A 在错误引发位点的引发效率相对比较高,而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。?引物的 GC 含量一般为 45-55% ,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。?引物所对应模板序列的 Tm 值最好在 72℃左右,当然由于模板序列本身的组成决定其 Tm 值可能偏低或偏高, 可根据具体情况灵活运用。引物设计要点?ΔG 值反映了引物与模板结合的强弱程度,也是一个重要的引物评价指标,一般情况下,在 Oligo 软件的Δ G 值窗口中,引物的ΔG 值最好呈正弦曲线形状,即 5’端和中间部分ΔG 值较高,而 3’端ΔG 值相对较低,且不要超过 9(ΔG 值为负值,这里取绝对值),如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。分析其原理, 引物与模板应具有较高的结合能量,这样有利于引物与模板序列的整合,因此 5’端与中间段的ΔG 值应较高, 而3’端ΔG值影响 DNA 聚合酶对模板 DNA 的解链,过高则不利于这一步骤。引物设计要点?可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性,相似性高则错误引发率高,错误引发的引发率一般不要高过 100 ,最好没有错误引发位点,如此可以保证不出非目的产物的假带。?引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过 ,否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致 PCR 正常反应不能进行。?对引物的修饰一般是增加酶切位点,应参考载体的限制酶识别序列确定,常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列,以有利于以后的工作。关于引物的自动搜索和评价分析?推荐使用自动搜索软件: Primer Premier ?推荐使用引物评价软件: Oligo 5/6 OLIGO PCR 引物设计第四讲多序列对位排列分析第四讲多序列对位排列分析 2008-3-17 9 主要应用于分析基因或蛋白质的进化通过分析多个基因或蛋白质序列之间的同源性确定它们在进化上的关系分析基因家族中新成员的翻译起始位点和内含子(预测的氨基酸序列的对位排列分析) 分析基因或蛋白质的功能 1. 多序列对位排列分析( multiple sequence alignment) 两条以上序列的对位排列分析反转录转座子的反转录酶序列片段