文档介绍：设备培训----- 高效液相色谱 概述高效液相色谱法( HPLC )是 20世纪 60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术,随着不断改进与发展,目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上,引入了气相色谱的理论,在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器,因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。色谱原理?色谱法的分离原理是:溶于流动相(mobile phase) 中的各组分经过固定相时由于与固定相(stationary phase) 发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同在固定相中滞留时间不同从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法高效液相色谱仪?高效液相色谱仪的结构:一般可分为 5个主要部分:高压输液系统、进样系统、色谱分离系统、检测系统、数据处理系统。其工作过程如下:首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱,然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时,流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离,然后依先后顺序进入检测器, 记录仪将检测器送出的信号记录下来,由此得到液相色谱图。?一、高压输液系统?由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细, 因此对流动相阻力很大,为使流动相较快流动,必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件,一般由储液装置、脱气装置、高压输液泵、过滤器等组成,其中高压输液泵是核心部件。输液泵分为恒流泵和恒压泵两种,但是目前恒流泵已经基本取代了恒压泵。? 1、输液泵应具备性能: ? A 、流量稳定,其变异系数应小于 % ,这对定性定量的准确性至关重要; ? B 、流量范围宽,分析型应该在 01- 10mL/min 范围内连续可调,制备型应能达到 100mL/min ; ? C 、输出压力高,一般应能达到 150- 300kgf/cm2 ( kgf/cm2= ); ? D 、液缸溶剂小; ? E 、密封性好,耐腐蚀。 2、输液泵的使用和维护注意事项 A、防止任何固体微粒进入泵体,因为尘埃或其他任何杂质微粒都能磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀,因此应预先除去流动相中的任何固体微粒; B、流动相不应含有任何腐性物质含有缓冲液的流动相不应保留在柱内,尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果含有缓冲溶液的流动相在柱内,由于蒸发或泄漏,甚至由于溶液的静置,就可能析出盐的微细晶体。这些晶粒将损坏密封环和柱塞等。因此,仪器在关机前必须将泵清洗干净,再换成适合色谱柱保存的和有利于泵维护的溶剂。 C、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完,否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环,最终产生漏液。 D、输液泵的最高压力不要超过规定的最高压力值,否则会使高压密封环变形。 E、流动相应该先脱气,以免在泵内产生气泡,影响流量的稳定。二、进样系统?高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多(约 5~ 30cm ),所以柱外展宽( 又称柱外效应)较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽,主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素,因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。? 1 、进样装置要求:密封性好,死体积小,重复性好,保证中心进样,进样时对色谱柱系统的压力、流量影响小。? 2 、进样方式:隔膜泵进样、停留进样、阀进样、自动进样。三、色谱分离系统?色谱分离系统包括:色谱柱、固定相和流动相。其中,色谱柱是其核心部分。? 1、色谱柱的构造?色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限,故金属管用得较多。? 2、色谱柱的类型?色谱柱按照用途分为分析型和制备型两类。? a、常规分析柱(常量柱)一般色谱柱长 10 ~ 30cm ,内径为 2~ 5mm (常量 ,国内有 4mm 和 5mm ),凝胶色谱柱内径 3~ 12mm ,制备往内径较大,可达 25mm 以上。? b 、窄径柱(细管径柱、半微量柱)柱长 10~ 30cm ,内径 1~ 2mm ? c、毛细管柱(微柱)内径 ~ d、半制备柱,内径>5mm 。 e、实验室制备柱,柱长 10 ~ 30cm ,内径 20 ~ 40mm f、生产制备柱,内径可达几十厘米。注: 一般在分离前备有一个前置柱,前置柱内填充物和分离柱完全一样,这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和,使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相,保证分离技的性能不受影响。 3、色谱柱的使用和注意事项 A、避免温度和压力的急剧变化及任何机械振动。温度的突然变化或者使色谱柱