文档介绍：DNA测序仪的原理及应用
上海交通大学分析测试中心侯敬丽
内容
DNA测序原理
CEQ8000 DNA测序仪
•基因测序系统的应用
引
-基因组DNA:染色体
-质粒DNA:细菌细胞
-线粒体DNA:胞浆
A ■ adonlm T" ttwmhB G ■ guinhs
CHG3rtoalno
-人工染色体DNA:
BAC YAC
一 cDNA
双脱氧链末端终止法
1977年，Sanger^人发展建立起来的一种DNA 测序方法。
基本原理：
双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂一类似于正常dNTP的2,,3，■双脱氧核昔三磷酸(ddNTP),将延伸的DNA链特异性地终止。其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶。共分四组，每组按一定比例加入一种(ddNTP),它能随机渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核昔酸必定为该种核昔酸，可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核昔酸序列。
Sange啲酶降解测序法（涟终止法）
这项技术的关键是在DNA的聚合过程中依赖特殊反应底物（才3’ 一双脱氧核昔三磷酸ddNTP）的特异性终止进行DNaW序。
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双脱氧链末端终止法测序基本原理示意
双脱氧链末端终止法特点
双脱氧链末端终止法不仅具有化学测序法的优点，而且更适用于大规模的测序。但它要求有一个纯淳的单链DNA模板和一个合成皮应所需的才寺异性的引物。因此，早期的工作仅局限于单链噬菌体为模板，若干个不同的特定限制性内切酶酶解片段为引物，在模板链的不同部位引导合成，从而确定岀噬菌体DNA的核酸序列。然而，对于大量存在着的天然双链DNA分子，因没有良好的制备产量和质量高的分离链的技术，而限制了双脱氧链末端终止法的应用程度。
经典的双脱氧链末端终止法
测序技术的改进
标记物方面的改进：由于放射性同位素对人体的危害，许多实验室开始利用非放射性物质来取代放射性同位素。如生物素、***、银染法、荧光标记物等化学发光物在双脱氧法测序时，它们作为标记物，示踪测序反应的产物，最后通过酶显色反应或者荧光信号显示岀测序的结果。这些方法比传统的放射性同位素方法检测容易、安全、快速、费用也低。