文档介绍：第四节化学致突变物的检测
 
一、致突变试验
(一) 基因突变试验

又称Ames试验,检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。试验菌株都有组氨酸突变(his-),不能自行合成组氨酸,在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长,回复突变成野生型后能自行合成组氨酸,可在最低营养平皿上生长成可见菌落。计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。标准试验菌株有四种:TA97和TA98检测移码突变、TA100检测硷基置换突变、TA102对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感。这四个试验菌株除了含有his-突变,还有一些附加突变,以提高敏感性。
试验方法有点试验(预试验)和掺入试验(标准试验)两种。在掺入试验中,受试物最高剂量为5mg/皿或出现毒性及沉降的剂量,至少有五个剂量点,并有阴性(溶剂)对照和阳性对照。将受试物、试验菌株培养物和S9混合液加到顶层培养基中,混匀后铺在最低营养平皿上,37℃培养48小时,计数可见菌落数。判断阳性结果的标准是,如每皿回变菌落数为阴性对照的每皿回变菌落数的两倍以上,并有剂量-反应关系,即认为此受试物为鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。
S9混合液是用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆9000Xg上清液(S9)加上NADP及葡萄糖-6-磷酸等辅助因子,作为代谢活化系统。如不加S9混合液得到阳性结果,说明受试物是直接致突变物;加S9混合液才得到阳性结果,说明该受试物是间接致突变物。只要在一种试验菌株得到阳性结果,即认为受试物是致突变物;仅当四种试验菌株均得到阴性结果,才认为受试物是非致突变物。

哺乳动物体外培养细胞的基因正向突变试验常用的测试系统有小鼠淋巴瘤L5178Y细胞,中国仓鼠肺V79细胞和卵巢CHO细胞的三个基因位点的突变,即次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+/K+ATP酶(OUA)位点。HGRPT和Na+/K+ATP酶位点突变可用于上述三种细胞,OUA位点突变仅适用于CHO细胞,HGRPT和TK可分别使6-硫代鸟嘌呤(6-TG)转移上磷酸核糖及使5-溴脱氧尿苷磷酰化,它们的代谢产物可掺入DNA引起细胞死亡,因此正常细胞在含有这些硷基类似物的培养基中不能生长,在致突变物作用下此两个位点发生突变的细胞对这些硷基类似物具有抗药性,可以增殖成为克隆(细胞集落)。Na+/K+ATP酶是细胞膜上的Na+/K泵,鸟本苷可抑制此酶活性引起细胞死亡,当致突变物引起该位点突变后,Na+/K+ATP酶对鸟本苷的亲和力下降,而酶活性不变,故对培养基中的鸟本苷产生抗药性,并可增殖为克隆。
(二) 染色体畸变试验

观察染色体形态结构和数目改变称为染色体分析。在国外常称为细胞遗传学检验,但这一名称有时广义地包括微核试验和SCE试验,因为这两个试验同样也是在显微镜下观察细胞染色体的改变。
对于结构畸变,一般只观察到裂隙、断裂、断片、微小体、染色体环、粉碎、双或多着丝粒染色体和射体。对于缺失,除染色单体缺失外,需作核型分析。即染色体摄影拍片后,再排列进行细微观察或用电子计算机进行图象分析。对于相互易位,除生殖细胞非同源性染色体相互易位外,倒位、插入、重复等均需显带染色才能发现。
对