文档介绍：1
霍乱弧菌检验操作规程
范围
本操作规程规定了带菌者粪便，患者粪便、呕吐物、肛拭子，外环境水样，水生动物、食品等标本中的霍乱弧菌的检验方法。
检验依据
国家传染病诊断标准： WS 289— 2008 卫生部疾病控制司《霍乱防治手册》第五版北京市卫生防疫站《卫生防疫微生物检验操作规程》《北京市常见传染病防制工作手册》（北京市疾病预防控制中心传地所 2008 年 12 月内部资料）
设备和材料
冰箱：-20 C 〜4C。
恒温培养箱：36 ± 1C。
暗视野显微镜： 10X〜100X。
架盘药物天平： 0g〜500g, 精确至。
锥形瓶： 100 mL、500 mL。
灭菌吸管：1mL （）、10mL （）。
灭菌平皿：直径 90 mm。
灭菌试管：10 mnh< 75 mm 16 mmK 160 mm。
灭菌注射器： 1 mL 。
载玻片。
盖玻片。
无菌棉签。
500mL 灭菌采样瓶。
生物安全柜：n级。
培养基和试剂
碱性蛋白胨水（- , 10— 15mL/管，10 X 50mL/瓶）。
庆大霉素琼脂（15-20 mL/块）。
普通营养琼脂（15-20 mL/块）。
半固体培养基（3mL/小管，5mL/中管）。
霍乱弧菌单克隆抗体（国家CDC流研所提供，5 —10卩L/菌落）。
泰国S& A诊断血清（5 —10卩L/菌落）。
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检验程序
霍乱弧菌检验程序见图 1。
标本的收集与送检
要求见表标准与要求（一）—（四）
操作步骤
快速辅助诊断：其结果只是初步报告，不是确诊报告。
动力及动力抑制试验：
如是急性期病人的水样便，则用接种环或滴管取 1 滴水样便在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力；或加生理盐水 1 滴在玻片上，用接种环取较干的便 1 环放置生理盐水中研匀，盖上盖玻片直接用暗视野显微镜观察动力；高度可疑的标本可取已增菌的碱性蛋白胨水 1 滴在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力。如在镜下见到穿梭样运动（象夜空中的流星）即动力试验阳性，否则阴性。
动力试验阳性的标本，则取 01和0139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体各 2滴放置
玻片上，取标本 1 滴或 1 环放在其中研匀，盖上盖玻片，用暗视野显微镜观察是否有原来的穿梭样运动，如穿梭样运动已迅速停止并凝集成块状即动力抑制试验阳性，否则阴性。
动力试验和动力抑制试验结果可口头初步报告，但不是确诊报告。双阳时口头报告高度可疑。
分离培养
粪便、呕吐物和肛拭子：对急性期病人水样便标本在碱性蛋白胨水增菌培养的同时
可用接种环取一满环或用棉拭子直接接种在庆大霉素琼脂培养基上；所有病人标本都应接种碱性蛋白胨水增菌培养。37C增菌6〜8h后，从菌膜下表层取一接种环培养物，把接种环在
试管壁上轻轻碰一下，待接种环上留有残液后划线接种庆大霉素琼脂培养基，划线时接种环
在基线处反复多次划线以接种的菌液干了为准，最后用接种环从基线处开始不间断划线到完成或四区划线（必须划出单个菌落）。37C培养，18h-24h。必要时（高度可疑或密接服药的
病人）可取第一次增菌液 1 mL转种于8-10mL碱性胨水管中37C二次增菌培养 6〜8h后做
分离。
水样：十倍浓缩碱胨水增菌培养法
水体的采集一般用无菌的 500mL水样瓶采集相对静止的表层水（深度为30cm以内）
500mL, 2〜3小时内送检。取 450mL水样，用1mol/L氢氧化钠调整至 -。然后加
10倍浓缩碱性胨水 50mL为抑制杂菌可再加入 1% mL和1000单位/ mL青霉
素1 mL。37C培养过夜划线接种庆大霉素琼脂培养基，接种划线方法同。培养时把瓶
盖打开三分之一。培养后取菌膜下表层培养物 - mL接转种于10mL碱性胨水管中作二
次增菌，37C培养6〜8h ,再划线接种庆大霉素琼脂培养基， 37C培养18-24h。接种划线方
法同。
食品及水产品样本：
液体食品：同
涂抹标本：使用无菌棉签涂抹 3〜5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔或食品
等表面，直接接种到 10 mL碱性蛋白胨水，37C增菌培养8〜12h划线培养。同时取菌膜下表层培养物接种庆大培养基分离培养同时吸〜 mL转种于10mL碱性胨水管中作二次
增菌，37 C培养8〜12h再划线接种庆大霉素琼脂培养基， 37 C培养18-24h。接种划线方
3
4
法同。
固体