文档介绍：克隆表达操作规程
PCR体系：
组 分
体 积
10x Buffer(Mg2+ Plus)
10ul
dNTP(10mM each)
2ul
Primer(10mM)
2ul+2ul
DNA
1ul
ddH2O
82ul
Taq
1ul
合计
100ul
PCR完成后取2ul跑电泳，按日期保存胶图。
PCR产物胶回收：按照试剂盒操作，Buffer A溶胶温度为65℃，W2溶液洗2次！ddH2O洗脱体积40ul
PCR产物和载体酶切：PCR产物取2ug，60ul酶切体系。37℃酶切过夜，早上来65℃加热20分钟。
纯化酶切产物：加入6ul 3M NaAC，混匀后加200ul体积冷冻无水乙醇，混匀后置-20℃冻1小时后12000rpm离心5分钟***@4℃，小心吸去上清，再加入200ul 70%冷冻乙醇，轻弹几下后马上12000rpm离心3分钟***@4℃，小心吸去上清，平放置37℃烘箱5-10分钟。用15ul ddH2O溶解，取1ul电泳定量。
连接反应：酶切后载体取150ng,酶切后DNA取300ng，加入所需ddH2O后在45℃加热5分钟，再加入2ul 10X Buffer，1ul T4 连接酶，总体系20ul。22℃连接过夜，早上来65℃加热10分钟。
连接产物转化DH5α感受态细胞：取6-8ul连接产物加入到DH5α感受态细胞，弹匀后放置冰上30分钟，中间弹匀1-2次，42℃热激60-90秒，放置冰上1分钟，加入无抗LB 500ul，弹匀后放置37℃水浴1小时，中间弹匀1-2次。将管内溶液全部倒在平板上，铺平后正放在37℃培养。
克隆鉴定：挑取4-6个单克隆到2ml TB培养基，2-3小时后取2ul拉PCR鉴定（用对应的PCR引物），保留两个阳性克隆继续培养至菌液足够浓后抽质粒，转化BL21(DE3)感受态细胞。注意保留阳性克隆菌液或者质粒送去测序！
小摇表达测试：分别挑取两个单菌落至1ml TB培养基，其中一管不诱导做为对照， IPTG，继续培养2小时，取500ul到离心管，12000离心1分钟，倒掉上清，加100ul PBS溶液，震散后加50ul 3X SDS loading Buffer，混匀后95℃煮10分钟，跑蛋白电泳检测是否有高表达。
大规模蛋白表达：上午8:30，挑取4个BL21(DE3)单菌落于400ml LB（注意在加完抗生素后取对照），摇床设置******@37C。下午，分光光度计OD600 = -()，