文档介绍：浙江大学博士论文摘要巨噬细胞侵染增强因子Mip(macrophage infectivity potentiator,Mip)是人的病原细菌嗜肺军团菌(￡egionella pneumophila)中的重要致病因子,它属于FKBP类型的肽基脯氨酰基顺反异构酶(peptidylprolyl cis—trans isomerase,PPIase) (FKBPs)。 MiP或Mip一1ike蛋白也是其它一些人或动物病原生物如Q热立克次体(Coxiella ii)和沙门伤寒氏菌(工typhimurium)的致病因子。在植物病原细菌中,只有木质都难养细菌(∥一elTa fastidiosa)基因组中注释了一个名为mip-1ike的基因,至于 mip-like在其它植物病原细菌中是否存在以及其生物学功能未见报道。本研究中,我们用木质部难养细菌的Mip—like蛋白的氨基酸序列去搜索野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(XBnthol;lonas campesiris Xcc)(该菌是引起十字花科植物黑腐病的病原菌)8004菌株的基因组,发现基因XC2699(原来注释为肽基脯氨酰基顺反异构酶) 与木质部难养细菌的mip-like基因和嗜肺军团菌的mip基因在氨基酸水平上分别有85% 和49%的相似性。为此,我们将XC2699重新命名为mip-1ike。为了确定0RF2699编码的产物是否是一个肽基脯氨酰基顺反异构酶以及其类型,我们将该0RF2699的编码区序列克隆到载体pET一30上并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行过量表达,然后将带有六组氨酸标记的野油菜黄单胞菌野油莱致病变种的Mip一1ike融合蛋白纯化,并用蛋白酶偶联法,以N。Suc-Ala—Ala—Pro——nitroanilide为底物测定了该蛋白的PPIase酶活性,结果证实纯化后的目标蛋白具有肽基脯氨酰基顺反异构酶活性;其I(111 【【×104 S~,Kcat/ ,其活性能被免疫抑制药物FK506特异抑制而不受另一种免疫抑制药物环孢菌素A(clycosporin A)抑制。这些结果证明XC2699是一个mip-like基因,XccMip—like 蛋白是一个FKBP类肽基脯氨酰基顺反异构酶。为了确定Mip—like蛋白在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中的生物学功能,我们利用***质粒pKl8mob整合突变方法构建了脚矿like基因的非极性突变体,并在寄主植物满身红萝h(Raphanus satiVUS ,s,)上用剪叶法测定了其致病性,结果发现,接种十天后,接种mip-l mm,,而且突变体致病性的降低能被一个野生型的mip—like基因反式互补( film)。这一结果证明mip-like基因是Xec致病所需要的。为了了解mip一1ike基因影响致病的机制, 我们进一步检测了该突变体在培养基上的生长情况以及致病因子产生情况,结果发现(i) mip—like突变体NK2699在NYGA培养基上的生长与野生型菌株8004基本一致;但在基本培养基上该突变体的生长非常差,而野生型菌株和互补菌株生长良好:(ii)删矿like突 TI 浙江大学博士论文变体NK2699的胞外多糖(EP$)产量比野生型菌株8004显著降低; (iii)mip一1ike突变体NK2699几乎检测不到胞外蛋白酶的活性,胞外纤维素酶,胞外淀粉酶的活性也比野生型8004明显降低。这些结果说明mip—like基因是屁c在基本培养基上的生长和一些致病因子的产生所需要的。为了进一步了解Mip—like蛋白PPIase活性对其生物学功能的贡献,我们利用定点突变的方法对该蛋白进行氨基酸置换,确定了三个酶活性必需氨基酸残基:第192Met、207Ala 和218Pro,同时也得到了一些PPIase活性不同程度降低的氨基酸置换突变体。通过利用带有不同点突变的Mip—like蛋白对mip-like突变体进行功能互补的方法,对Mip—like蛋白的PPIase活性与其生物学功能的关系进行了评价,发现这三个丧失了PPIase活性的舱c Mip一1ike蛋白仍然可以互补mip-like突变体NK2699的致病性,这说明PHase活性对屁c Mip—like蛋白的致病功能是没有贡献的。关键词:野油菜黄单胞菌野油莱致病变种,脚p基因,mTp-1ike基因,肽基脯氨酰基顺反异构酶(PPIase),致病基因浙江大学博十论文 Abstra