文档介绍：免疫酶技术基本原理?免疫标记技术( immunolabelling technique ):是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂,标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。特点: 高度灵敏、特异、快速,定性、定量、定位分类: 免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。?免疫酶技术: 是利用酶标记抗体或抗原,以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。实验一: ELISA 方法检测人血清中 IgG ?酶联免疫吸附试验( enzyme linked immunosor - bent assay, ELISA ) ?是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使抗原抗体反应在固相表面进行。常用的酶: 辣根过氧化物酶底物为邻苯二胺。常用的方法: 间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。双抗体夹心法: 用于检测特异抗原。将已知抗体包被固相,加入待检标本,标本中含有相应抗原即与固相上的抗体结合,洗涤去除未结合成分,加入该抗原特异的酶标记抗体,加底物显色。目的: *掌握 ELISA 技术*检测血清中 IgG 含量材料: ?抗人 IgG 抗体(羊抗人 IgG 抗体)(一抗) ?已知 IgG 含量的参考蛋白(作标准系列) ?待检人血清?辣根过氧化物酶标记的抗人 IgG 抗体(二抗) ?包被液: 碳酸盐缓冲液?洗涤液: PBS ?底物溶液: OPD-H 2O 2?终止液: 2mol/L H 2S0 4?酶标反应板(一排/人) 操作步骤?包被(用一抗包被)(已做) ?洗涤 3次(将洗液加入每孔, 3min 后倾去) ?加样:将已知含量的参考蛋白 IgG 倍比稀释 7孔,第 8孔加待检血清,第 9孔加阴性血清第10孔作空白对照( 100 ul/孔)。 100 ul 稀释液待测血清 PBS- T20 100 ul 标准品 100 ul 100 ul ?孵育( 37℃ 40 min ) ?洗涤 3次?加酶标记的抗人 IgG 抗体(即二抗) (100 ul/孔)?孵育( 37 ℃ 40 min ) ?洗涤 3次?显色(加底物溶液, 100 ul/孔。室温避光15-30 min ) ?终止反应?检测(490 nm波长下检测) ?结果观察与分析: 空白对照应无色; 阳性孔呈棕黄色, 标准系列各孔呈明显的颜色深浅梯度; 绘制标准曲线。?注意事项: 做倍比稀释时,应从高浓度到低浓度; 显色时一定避光; 检测时应避免孔中有气泡。实验二 APAAP 法检测淋巴细胞亚群?原理: 用抗人 T细胞 CD的McAb 与T细胞的反应,用羊抗鼠 IgG 搭桥,其中一个 Fab 段连接抗 T的McAb , 另一个 Fab 段连接 APAAP 复合物,再通过复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色来判断 CD分子的存在, 从而确定 T细胞的各亚群。?优点: *不经化学交联反应,避免了抗体和酶活性降低。*省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。*标本易于检测,保持时间长。?应用: *淋巴细胞分化抗原; *活化抗原; *MHC- Ⅰ、Ⅱ类抗原表达的检测。