文档介绍：上海交通大学
博士学位论文
产紫杉醇内生真菌的遗传转化及紫杉醇合成途径相关基因的克
隆
姓名:汪业春
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:唐克轩
20070601
岁≯震童名謦博士学位论文产紫杉醇内生真菌的遗传转化及紫杉醇合成途径相关基因的克隆摘要同的内生真菌菌株,经三周摇床培养发酵、提取、浓缩后经Ⅲ,、.紫杉醇是高效、低毒、广谱的天然抗癌药物,目前临床和科研所需的紫杉醇主要是从红豆杉中直接提取或是经化学半合成法合成。但是,天然红豆杉资源的稀缺、生长缓慢以及紫杉醇含量又极低制约了紫杉醇的市场供应。因此,采用各种手段积极寻求紫杉醇新药源生产途径,扩大紫杉醇供应能力,已成为紫杉醇产业发展的重点研究方向之一。以真菌取代红豆杉作为紫杉醇的药源,通过微生物发酵工程生产紫杉醇,也许是解决药源短缺的有效途径之一。为解决紫杉醇药源短缺问题,本研究从两个方面开展研究:一是从我国珍稀药用植物红豆杉树皮中分离产紫杉醇的内生真菌,同时克隆内生真菌中紫杉醇合成途径相关基因并建立内生真菌的遗传转化系统,并将紫杉醇合成途径关键酶基因构建到真菌表达载体上,为利用基因工程手段提高内生真菌中紫杉醇含量、最终实现利用真菌发酵方法商业化生产紫杉醇打下基础。二是从产紫杉醇植物欧洲榛子中克隆紫杉醇合成途径相关基因,为今后利用基因工程手段将紫杉醇生物合成途径关键酶基因导入山榛中来提高紫杉醇含量提供候选基因。本研究得到如下结果:利用表面消毒除茵方法从野生南方红豆杉树皮中分离到霾对霾煌哪谏婢⒔鸵禾崛∥锝屑觳猓诒嗪盼狤的内
岁蓐震磊震·挚博士学位论文分析证明外源潮霉素基因已被成功整合到蜃橹校生真菌发酵液提取物中检测到了紫杉醇及其重要前体巴卡亭颉?拱┫胞活性实验结果表明,,该菌株不同于国内外已报道以本研究组以前分离到的产紫杉醇晡Q芯坎牧希捎娜ǔ蛄屑捌浠蜃樾蛄校没蛉ǔ白,序列比对结果表明,蚝兴母鐾庀宰雍腿瞿诤樱似性。杂交表明,该基因在蜃橹幸缘タ奖葱问酱嬖凇分析发现,虻谋泶锸芗谆岳蛩盏肌菌囊糯;逑导凹觳夥椒ǎ竦昧鑫榷ㄗ;樱琍和和分别构建到真菌表达载体W;仙即寄谏婢克隆了紫杉醇合成途径重要基因全长序列。菌的产紫杉醇内生真菌。技术,,编码一个具有霭被岵谢牡分析显示,该基因编码的氨基酸与其它真菌的有较高相成功建立了利用限制酶介导整合技术的产紫杉醇内生真化频率大约是个转化子/微克质粒8孟低车慕⑽=窈罄米杉醇合成途径关键基因转化产紫杉醇内生真菌、提高其中的紫杉醇含量打下了基础。首次将紫杉醇合成途径上的四个关键酶基因,,提供了备选载体。本研究采用技术首次从产紫杉醇植物欧洲榛子,
基因鹏因ǔ蛄小5鞍字市蛄卸嘀乇榷越峁砻鳎本研究采用技术首次从欧洲榛子蟹掷氲搅松岁劳震童名荸博士学位论文蛋白质序列多重比对发现,与其它植物的具有很高同源霰砻鳎珻粲谝桓龆嗷蚣易濉析发现,在榛子根、茎和叶中均表达,而在根中表达量最高。的表达受甲基茉莉酸诱导。功能测验实验表明,能加速大肠杆菌中胡萝卜素的积累,从而证明嗦胍桓龉δ艿性。白。訮鞍缀推渌参锢丛吹腎具有较高同源性。低撤⑸鞣治霰明,与其它植物来源的哂泄餐淖嫦取治霰砻鳎蚴粲谝桓龆嗷蚣易濉W橹匾煨员泶锓治鱿允荆珻:基因在榛子根中的表达量高于茎和叶中。功能测验实验表明,蚰加速大肠杆菌中胡萝卜素的积累,从而证明了饴胍桓龉δ艿鞍住本研究采用技术首次克隆出了山榛的基因ǔ蛄小5鞍字市蛄卸嘀乇榷越峁砻鳎鞍缀推渌参锢丛吹腉蛋白具有较高同源性,械湫偷囊煳煜┳R泼个氨基酸保守区系统发生树分析表明,。分析表明,蚴粲谝桓龆嗷蚣易濉分析表明,蛟谝吨械谋泶锪扛哂诟途ブ校谋泶锸芗谆岳蛩嵊盏肌本研究论文报道了从我国珍稀药用植物南方红豆杉中分离到一株产紫杉醇及其重要前体巴卡亭哪谏婢鶧克隆了产紫杉醇内生真菌械淖仙即己铣赏揪断喙鼗颉⒔⒘嘶.
锌寺×俗仙即己铣赏揪度鲋匾;,异性,以及觑惦占谆岳蛩嵊盏嫉谋泶锾卣鳎⒃诖蟪Ω多劳交童名謦博士学位论文径四个关键酶基因的真菌表达载体。同时,从产紫杉醇植物欧洲榛子菌中验证蚎掣料基因的功能。本研究为今后利用基因工程在分子水平上深入了解产紫杉醇内生真菌和山榛中紫杉醇合成及其代于技术的内生真菌遗传转化系统并分别构建了携带紫杉醇合成途,分析了这些基因在山榛基因组中的拷贝情况及组织表达特手段提高产紫杉醇内生真菌和山榛中紫杉醇的含量打下了基础,并对在谢调控机制具有重要意义。关键词:南方红豆杉,紫杉醇,内生真菌,高效液相色谱,限制酶介导整合,山榛
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