文档介绍：蛋白质检测办法汇总
-04-26 12:00:38|  分类：蛋白电泳 |  标签： |字号大中小 订阅
本文引用自啸月天狼《蛋白质检测办法汇总》
 
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蛋白质检测办法汇总
本实验目是学会各种蛋白质含量测定办法。
理解各种测定办法基本原理和优缺陷。
  蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最惯用、最基本分析办法之一。当前惯用有四种古老典型办法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸取法。此外尚有一种近十年才普遍使用起来新测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法敏捷度最高，比紫外吸取法敏捷10～20倍，比Biuret法敏捷100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较精确，往往以定氮法测定蛋白质作为其她办法原则蛋白质。
  值得注意是，这后四种办法并不能在任何条件下合用于任何形式蛋白质，由于一种蛋白质溶液用这四种办法测定，有也许得出四种不同成果。每种测定法都不是完美无缺，均有其优缺陷。
在选取办法时应考虑：
①实验对测定所规定敏捷度和精准度；
②蛋白质性质；
③溶液中存在干扰物质；
④测定所要耗费时间。
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出长处，正得到越来越广泛应用。
一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，依照此酸液被中和限度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反映式如下：
  CH2COOH
  |         + 3H2SO4--------- 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3   (1)
  NH2
    2NH3 + H2SO4 -------- ---(NH4)2SO4               (2)
  (NH4)2SO4 + 2NaOH ----------- 2H2O +Na2SO4 + 2NH3       (3)
    反映（1）、(2)在凯氏瓶内完毕，反映（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算办法这里从略。计算所得成果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
    五种蛋白质测定办法比较如下：
办法      敏捷度      时间      原理      干扰物质     阐明
凯氏定氮法（Kjedahl法）  敏捷度低，~ ，误差为 ±2％      费时   8～10小时      将蛋白氮转化为氨，用酸吸取后滴定      非蛋白氮（可用三***乙酸沉淀蛋白质而分离）      用于原则蛋白质含量精确测定；干扰少；费时太长
双缩脲法（Biuret法）    敏捷度低1～20mg    中速   20~30分钟      多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物      硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸      用于迅速测定，但不太敏捷；不同蛋白质显色相似
紫外吸取法      较为敏捷50～100mg      迅速   5～10分钟      蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基在280nm处光吸取      各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸      用于层析柱流出液检测；核酸吸取可以校正
Folin－酚试剂法（Lowry法）      敏捷度高～5mg      慢速 40～60分钟      双缩脲反映；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原      硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇      耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法(Bradford法)      敏捷度最高1～5mg      迅速5～15分钟      考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm      强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS      最佳办法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化
二、双缩脲法（Biuret法）
（一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一种分子氨后得到产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反映。凡具备两个酰***基或两个直接连接肽键，或能过一种中间碳原子相连肽键，此类化合物均有双缩脲反映。
                 
                  H2O
   