文档介绍：实时荧光定量 PCR 实验的设计及结果的分析基因有限公司王争强对照组对照组对照组对照组::: :用作对照的样本,与实验组进行比较实验组实验组实验组实验组::: :未知样本,用于研究目的基因目的基因目的基因目的基因(GOI) :用于研究的基因内参基因内参基因内参基因内参基因( 看家基因看家基因看家基因看家基因) ::: :基因表达量比较恒定的基因,用于校正起始上样量的区别参比样本参比样本参比样本参比样本(Calibrator): 用于比较的样本,如未处理样本、正常组织、 0 时相样本等标准品标准品标准品标准品(Standards) ::: :梯度稀释的已知浓度的样品,测定未知样品的浓度和反应效率 Ct 值值值值: :: :样品扩增产物的荧光信号达到所设定的荧光阈值时需要的循环数反应效率反应效率反应效率反应效率(E) ::: : PCR 扩增的速率术语术语术语术语 RT-qPCR 流程示意图样本的准备样本的准备样本的准备样本的准备?速度(RNA 降解) ? RNA 酶抑制剂?保存条件分离试剂的选择分离试剂的选择分离试剂的选择分离试剂的选择?液态或组织?植物、动物或者微生物 RNA 质控质控质控质控? RNA 的完整性? RNA 的纯度? RNA 的浓度?抑制因子的影响 RNA 提取提取提取提取逆转录引物逆转录引物逆转录引物逆转录引物?随机六核苷酸引物( 总 RNA) 或者 OligodT 引物(mRNA) ?扩增产物在 5’端时,尽量避免用 OligodT 做引物逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶?较高的逆转温度可以减少 cDNA 二级结构的形成(Freeman et al. 1996). 逆转录效率逆转录效率逆转录效率逆转录效率?理论上 RNA/mRNA 逆转录成 cDNA 的效率是 100% (< 70%) ?单链结合染料 Oligreen ? 可以用于测定 cDNA 的浓度逆转录逆转录逆转录逆转录实时扩增实时扩增实时扩增实时扩增插入式染料插入式染料插入式染料插入式染料?成本低?适用于所有的双链?研究基因较多时适用?特异性低双标记水解探针双标记水解探针双标记水解探针双标记水解探针((( ( TaqMan 探针探针探针探针))) ) ?特异性高?目的基因浓度低时结果可靠?需要设计探针及反应条件优化?目的基因较少时适用?成本较高荧光物质的选择荧光物质的选择荧光物质的选择荧光物质的选择实时检测实时检测实时检测实时检测: SYBR ? Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’激发 R QQ R Q R 激发实时检测: 双标记探针免费的基于网络的设计软件免费的基于网络的设计软件免费的基于网络的设计软件免费的基于网络的设计软件 Primer3 ((( ( / ))) ) ?引物和双标记水解探针的设计? Tm 的计算 MFold ((( ( -s ))) ) ?引物和扩怎产物二级结构的预测?二级结构的稳定性(delta G) 和融解温度(T m ) BLAST ?结构特异性引物和探针的设计引物和探针的设计引物和探针的设计引物和探针的设计