文档介绍：试验三 细菌纯种分离、培养和接种技术
一、试验目标
    (1)了解和学****水中细菌总数和大肠菌群测定原理和测定意义。
    (2)学****和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数方法。
    (3)学****和掌握水中大肠菌群检测方法。
二、试验原理
    水微生物学检验，尤其是肠道细菌检验，在确保饮水安全和控制传染病上有着关键意义，同时也是评价水质情况关键指标。国家饮用水标准要求，饮用水中大肠菌群数每升中不超出3个，细菌总数每mL不超出100个。它反应是检样中活菌数量。
    所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌总称。 水大肠菌群数是指100mL水检样内含有大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。水源中大肠菌群数量，是直接反应水源被人畜排泄物污染一项关键指标。现在，国际上已公认大肠菌群存在是粪便污染指标。所以对饮用水必需进行大肠菌群检验。
   水中大肠菌群检验方法，常见多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可利用于多种水样检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适适用于杂质较多、易于阻塞滤孔水样。
三、试验材料
1、菌落总数测定：
1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
2、大肠菌群测定：
    1)培养基：
    ①乳糖胆盐蛋白胨培养基：
    蛋白胨20g，胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，。
    制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管
5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，121℃灭菌15min。
    ②伊红美蓝琼脂培养基：
制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
平板划线法：接种是采取平板划线方法将初发酵大肠杆菌进行接种。
四、试验方法
1、水样采集：
    1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
    2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm深层水样，先将灭菌具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。假如不能在2h内检测，需放入冰箱中保留。
2、细菌总数测定：
    1)水样稀释及培养：
①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释；
  ②依据对水样污染情况估量，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，通常选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁可选择1:10、1:100、1:1000三种稀释度；污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸收1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个反复。
    ③将熔化后保温度45℃牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。
    ④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含细菌菌落总数。