文档介绍：酶的提取、分离与纯化制作人:雒宏琳王萍萍?选择合适的原料是提取酶的首要步骤,也是最关键的步骤。 1 1、原料选择遵循的原则、原料选择遵循的原则: (1)酶含量多,干扰物质少(2)来源丰富,保持新鲜(3)容易得到,提取工艺简单(4)稳定性好,安全性好(5)有综合利用价值酶的提取酶的提取提取酶的原则提取酶的原则?1、根据酶的特性,选择适当的溶剂?2、“少量多次”、低温操作?3、防止水解酶的作用,必要时加入一定的保护和稳定试剂?4、胞内酶的提取首先要将细胞破碎酶提取中应用组织和细胞破碎的方法酶提取中应用组织和细胞破碎的方法?1、碾磨法/组织捣碎?2、超声波破碎法?3、渗透压法(高渗或低渗处理) ?4、冻融法?5、表面活性剂处理法?6、***法(冷***脱水抽提) ?7、酶处理法?一、调节酶溶解度的方法?二、根据酶分子大小、形状不同的纯化方法?三、根据酶分子电荷性质的纯化方法?四、根据酶分子专一性结合的纯化方法?五、其他酶的分离和纯化酶的分离和纯化一、调节酶溶解度的方法一、调节酶溶解度的方法?1、等电点沉淀法等电点沉淀法:利用酶和蛋白质为***电解质,在等电点时溶解度最低并且不同的酶和蛋白质有不同的等电点。?该方法属于粗分离技术,主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白,沉淀可能不完全,还需和其他方法并用。?2、盐析法盐析法:盐离子与酶和蛋白质分子争夺水分子,减弱了酶和蛋白质的水和程度,降低其溶解度,从而达到分离纯化的目的。?此方法条件温和,且中性盐对酶分子有保护作用。?3、有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法:有机溶剂与水作用,能破坏酶分子周围的水膜,同时改变溶液的介电常数,导致酶溶解度降低而沉淀析出。?此方法析出的酶沉淀较盐析法容易过滤或离心分离,溶剂也易去除,但易使酶变性,需低温操作,一般与等电点沉淀法联合使用。?4、 PEG PEG (聚乙二醇)沉淀法(聚乙二醇)沉淀法: PEG 分子在溶液中形成网状结构,与溶液中的酶分子发生空间排挤作用,从而使酶分子凝聚而沉淀。?此技术操作简便、效果良好,因此在生化分离中被广泛采用。二、根据酶分子大小、形状不同的纯化方法二、根据酶分子大小、形状不同的纯化方法?1、离心分离技术离心分离技术:借助离心机旋转时所产生的离心力,而使分子大小、形状不同的物质分离开来。?在酶分离中一般要求使用具有冷冻装置的离心机。高速冷冻离心机?2、透析与超过滤技术透析与超过滤技术:利用透析膜与超滤膜的筛分机理,在一定条件下将酶提取液通过选择性透过膜,酶等大分子的物质被截留, 从而达到把小分子物质去除或同时达到浓缩酶液的目的。?3、过滤过滤:可使用助滤剂如 C盐(硅藻土材料) 以改善过滤速度。?4、凝胶层析技术凝胶层析技术:根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应不同而对物质进行分离纯化。?影响层析效果的因素:凝胶介质、洗脱液、样品上样量、样品溶液与洗脱液的相对黏度等。