文档介绍：关于蛋白质的裂解
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用Edman降解法测多肽链的氨基酸顺序，一次只能连续降解数十个残基，用手工方法最多测二十多个残基。然而，自然界蛋白质的分子量通常在一万以上，因此在测多肽链顺序时，需将它们先裂解成一系列小肽，分别测出它们的顺序，然后再找出它们的接头位置，才能定出该肽链的顺序。所以如何选择肽链裂解的切点，将对顺序测定起着重要作用
裂解条件要求： 裂解点少
专一性强
反应产率高
裂解方法： 酶法
化学法
酶解和化学裂解是顺序分析中互为补充缺一不可的手段
一、 引 言
早期：部分酸水解法裂解，由于专一性
低，裂解后生成很多小肽，造成
分离纯化困难，工作量也很大。
中期：生化学家改用蛋白酶酶解，因专
一性强，故被广泛地使用。
后来：随着自动顺序仪的广泛使用和对
大肽段的需求，发现某些化学试
剂对蛋白质的裂解有特异的优点。
化学法再流行。
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（－）简述
用特异性水解酶裂解肽链有许多优点：专一性强，降解后的肽段容易纯化，产率较高，副反应少，在酸水解中容易受破坏的谷氨酰氨、天冬酰氨和色氨酸等在酶解中都不受影响。
整个酶解反应中，酶解条件的选择相当重要，需要考虑下列因素：
（1）合适的pH
（2）适宜的反应温度
（3）恰当的酶与底物的比率
（4）选择相应的反应时间
二、蛋白质的酶裂解
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最常用的水解蛋白酶，专一性强,只断裂赖氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽键，用它裂解蛋白质常常可得到合适的肽段
商品胰蛋白酶中，常含有少量胰凝乳蛋白酶，这样，在酶解时会产生不希望有的肽片段。因此，使用前需用L-1（对-甲苯磺酰）苯丙氨酰***甲***（简称TPCK） 处理胰蛋白酶，以抑制胰凝乳蛋白酶的活力。也可直接订购用TPCK处理过的胰蛋白酶。
1、胰蛋白酶
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讨论：
如果蛋白质分子量较大，或遇到碱性蛋白含有较多的赖氨酸和精氨酸残基时，则酶解后的肽段数就会很多，将给顺序测定带来很***烦。
方法：用柠康酸酐可逆保护赖氨酸的ε-氨基，使胰蛋白酶酶解时不会在赖氨酸羧端裂解，而只在精氨酸的羧端裂解，以后也很容易去掉保护基团。
ε-氨基保护剂
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凝凝乳蛋白酶的前体是胰凝乳蛋白酶原，由245个氨基酸组成的单链，有5个二硫键。酶原本身没有水解活力，靠胰蛋白酶激活，在Arg15---Ile16 肽键处水解，形成 л- 胰凝乳蛋白酶。
而л-胰凝乳蛋白酶又反过来对本身起作用，酶解掉二个二肽 Ser 14- Arg15 和 Thr147 - Asn148，生成具完全活力的 a-胰凝乳蛋白酶。
因此a一胰凝乳蛋白酶由A、B、C三条多肽链组成，它们分别含有13，130，96个氨基酸残基。
2、胰凝乳蛋白酶
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凝凝乳蛋白酶的专一性不如胰蛋白酶，
酶解Tyr，Phe、Trp、Len等疏水氨基酸羧基所形成的肽链，
也能在val、Ile、Ser、Gly的羧端裂解，但较慢。如果被裂解的邻近基团是碱性的（如Lys、Arg或His），裂解能力将增加。倘若邻近是Pro或Phe—Pro，则不能酶解。
在酶解中，增加酶的比例（对底物）能提高酶解能力，这时，甚至象Ala-val键也能酶解。
凝凝乳蛋白酶
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专一性与胰凝乳蛋白酶类似
适宜酶解pH值是2
在顺序测定中很有价值，因为在确定二硫键的位置时，在这样的酸性环境下二硫键比较稳定，很少有二硫键的互换反应。反应条件选择恰当，可以变低特异性为高特异性。
，用胃蛋白酶酶解胰岛素于3℃，此后用lN NaOH调pH=9以终止反应。结果用Scphadex G-50柱（×110cm）分离得到了很纯的去B链羧端五肽胰岛素，说明胃蛋白酶在酶解中只降解胰岛素B链中第25位苯丙氨酸的羧基所形成的肽键（—Phc25- -THR26-Thr27-Pro28－LyS29-aLA30）