文档介绍：word
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总RNA的提取〔Trizol法提取〕
在收集到生物材料之后，最好能即刻进展RNA制备工作。假如需暂时储存，如此应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以参加液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以防止RNase的作用。
提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进展裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；
将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；
在上述EP管中，按照每1ml ，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下〔15℃～30℃〕放置2～3分钟后，12000g〔2℃～8℃〕离心15分钟；
取上层水相置于新EP管中,，在室温下〔15℃～30℃〕放置10分钟,12000g〔2℃～8℃〕离心10分钟；
弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进展洗涤，涡旋混合，7500g〔2℃～8℃〕离心5分钟，弃上清；
让沉淀的RNA在室温下自然枯燥；
用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
PCR
实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱廉价，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A〞碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进展基因的扩增请使用此酶。
按如下组成在PCR反响管中调制反响液：
TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方
Reagent
Quantity, for 50µl of reaction mixture
10X PCR buffer 〔Mg2+ free〕
5 µl
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MgCl2〔25mM〕
如TaKaRa TaqTM加3 µl
如TaKaRa EXTaqTM加4 µl
dNTP mix
4 µl
10µM Primer 上游
1 µl
10µM Primer下游
1 µl
Template DNA
1 µl
Taq或EXTaqDNA Polymerase
µl
Sterile deionized water
Up to 50µl
Total
50 µl /Sample
PyrobestTM DNA Polymerase的配方
Reagent
Quantity, for 50µl of reaction mixture
10X Pyrobest buffer
5µl
dNTP mix
4µl
10µM Primer上游
1µl
10µM Primer 下游
1µl
Template DNA
1µl
PyrobestTM DNA Polymerase
µl
Sterile deionized water
Up to 50µl
Total
50µl /Sample
反响总体积根据实际情况进展调控，可以做20~50µl以节约试剂；
；
如果不用PCR仪的加热盖，在反响混合液的上层加30 ~50µl 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；
按以下程序进展PCR扩增。
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PCR反响条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以与PCR结果而进展优化。
Step
Temperature, °C
Time, min
Number of cycles
Note
起始变性
94~95
1-3〔5〕
1
变性
94~95
25-35
退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反响结果优化
退火
37-70
延伸
70-75
根据扩增产物的大小〔〕
每分钟延伸1000bp
最终延伸
70-75