文档介绍：宏基因组实验计划
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宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划
起草人：李浩宇
宏基因组学研究方向及意义
研究：环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。
发掘：环境应激和应答基因的多态性。
探究：多态性基因的功能。
实验大体步骤：
：
1）避免人源污染，采样的器具都要高温灭菌，采样过程中要戴手套。
2） 样品的迅速处理保存。有条件最好用液氮冷冻运输，没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品，迅速用预冷缓冲液 (多为PBS)重悬，离心收集沉淀。分装成小份，冻存于液氮或者‐80 ℃ 冰箱中，避免反复冻融。
3）如果后续用间接法提取总DNA 的话，此处
土壤DNA 直接提取法：
(1) 从超低温冰箱中取出保存样品 (5 g)；
(2) 于室温融化；
(3) ml CTAB 抽提缓冲液和50 μl 蛋白酶K 贮存液；
(4) 离心管于37oC 225 rpm 水平振荡30 min；
(5) mL20%SDS；
(6) 65oC 水浴2 h，每隔15 min 轻轻颠倒数次；
(7) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，转移至一个新的50 ml 离心管中；
(8) ml ml 20%SDS，轻轻涡旋至混匀；
(9) 浸入液氮中冷冻3 min 后，于沸水中煮沸3 min；
(10) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，与上次上清液合并；
(11) 重复(8)、(9)、(10)一次；
(12) 将三次提取所获上清液与等体积的苯酚：***仿(1:1 v/v) 混合，摇匀后于4 ℃
12,000g 离心10 min；
(13) 将上层水相转移至一新的50 ml 离心管中，加入等体积的***仿：异戊醇(24:1)，
混匀后于4 ℃ 12,000g 离心10 min；
(14) 再次转移上清至一新的离心管中， 倍体积的异丙醇于室温沉淀1 h；
(15) 室温12,000g 离心20 min；
(16) 收集沉淀，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；
(17) 向离心管中加入1 ml TE，于4 ℃ 放置过夜，分装保存于‐20 ℃。
实验过程中的注意事项及一些技巧：
(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔，避免剧烈震荡(试剂盒提取除外)。
(2) 用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉，避免机械剪切。
(3)酚***仿抽提时，中间相一定不要吸到，宁可多丢弃一些。
(4) 异丙醇沉淀时不要放在低温， 倍体积室温沉淀足够了。
(5) DNA 溶解时可以放在4℃ 静置过夜，次日离心取上清去除多余杂质。
(6) 水平震荡可以用左右摇晃的震荡器。
水样DNA 间接提取法：
(1)抽滤的方式浓缩采集到的水样。
(2)采取差速离心取得水样中的菌体。
(3)取得微生物后进行裂解提取。
此方法还在查证中，具体前期对样品的处理方法还在整理中。
例如：用多少的水样进行浓缩，差速离心的转速选择。
会不会有DNA的丢失等等。
Epicentre推出了宏基因组DNA分离试剂盒（Metagenomic DNA Isolation Kit for Water）,能从水样中分离已随机剪切的，可直接用于fosmid克隆的DN***段。
此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物（包括革兰氏阳性菌）中提取40kb大小的DNA。提取的DNA可立即进行末端修复，并在乙醇沉淀洗涤后克隆到Epicentre的PCC1FOS载体上。
优势：
，琼脂糖块或大小选择。
/***仿提取。
，从低丰度的微生物中回收DNA的概率更大。
。
下图为方法与流程：
粗提DNA 的纯化