文档介绍：生物化学实验报告
——米氏常数的测定
学生姓名：张一学号：
实验序号：指导教师：丛峰松
实验时间： 11月5日实验地点：叶杰全楼205
底物浓度对酶促反应的影响——米氏常数的测定
一．目的要求
。
。
二．实验原理
酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示：
式中：
v——反应初速度（微摩尔浓度变化/min）；
V——最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）；
[s]——底物浓度（mol/L）；
Km——米氏常数（mol/L）。
这个方程表明当已知Km及V时，酶促反应速度与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶，Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可以近似地反应酶与底物的亲和力大小：Km值越大，表明亲和力小；Km值小，表明亲和力大。则测Km值是酶学研究的一个重要方法。～100mmol/L。
Linewaeaver-Burk作图法（双倒数作图法）是用实验方法测Km值的最常用的简便方法：

实验时可选择不同的[s]，测定对应的v，以对作图，得到一个斜率为
的直线，其截距则为，由此可求出Km的值（截距的负倒数）。
本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Linewaeaver-Burk双倒数作图法测定双倒数作图法。胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。

三．试剂和器材
试剂
～30g/L的酪蛋白溶液（）：
分别取10、20、25、30g酪蛋白溶于约900mL水中，加20mL 1mol/L NaOH连续振荡，微热直至溶解，以1mol/L HCl 或1mol/L ，定容1L，即生成四种不同[s]的酪蛋白标准溶液。
：
100mL分析甲醛加20 mL ％酚酞乙醇溶液， NaOH滴至微红，密闭于玻璃瓶中。
%酚酞乙醇溶液：
%乙醇溶解，并定容至1L。
NaOH溶液：
事先用邻苯二甲酸氢钾标定过。
材料
胰酶溶液：称取3g胰酶（胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶的混合物）溶于25ml蒸馏水中，放入冰箱保存。
器材
恒温水浴；50ml三角烧瓶（×16），150ml三角烧瓶（×4）；吸管5ml（×1），10ml（×5）；量筒100ml（×4）；25ml碱式滴定管及滴定台，蝴蝶夹；恒温水浴；滴管。
四．操作方法
1. 取50mL三角瓶4个，加入5mL甲醛与1滴酚酞，定至微红色，4个瓶颜色应当