文档介绍：捅要天冬氢酸转氨酶可以催化芳香族***基酸的合成和§晕解反应。本论文对大肠杆菌中的天冬氨酸转氨酶进行分离纯化,并对其酶学、动力学性质进行研究。首先通过硫酸铵分级沉淀、疏承层折、离子交换层析等方法对天冬氨酸转氨酶进行分离纯化,,%。同时通过SDS—PAGE电泳测得其亚基分子量约为43000Da左右。{"C,最适pH为8。5。然后对其动力学性质进行研究,因为该转化反应属于双底物、双产物转化反应,只能近似使用米氏方程,确定其表观米氏常数K。为 t6705mmol·L~,表观最大反应速度V。‰、,·L。·mlnT。。转氨酶的转氦反应机制都属于乒乓反应机制,因删采用乒乓反应机制对两步转氨反应进行研究,得出第一步转氨反应的米氏常数为8,28mrnol·L~,·L~。由此可知在两步转氨反应中第二步转氨反应为限速反应。即辅酶由***型转为醛型为关键反应步骤。因此推断在反应初始阶段,纯酶液中添加磷酸吡哆***比添热磷酸毗哆醛能更快的促进产物的生成。出实验验证,反应 10分钟后,添加磷酸吡哆***的AspA'%。120分钟后,%。本文采用聚丙烯酰***作为包埋材料,在细胞固定化中存在五种影响因素:凝胶浓度、交联度、过硫酸铵浓度、TEMED浓度、令菌量。因此采取血因素,硼水平的正交实验,确定细胞固定化的最适条件。由萨交实验确定大肠杆菌固定化的最适条件为:凝胶浓度为15%、交联度为5%、过硫酸锬加入量为400“L、 TEMED加入量为60u L、5%菌悬液加入量为2mL。-L’。,最大反应速度为0,06181lmmol·rain~。对游离细胞进行动力学常数测定,得出表观米氏常数为8 7848mmol·L~,·min~。将游离酶,游离细胞,固定化细胞的米氏常数和最大反应速度进行比较,游离酶的最大反应速度高于游离细自毡韵最大反应速度:且游离细胞的最大反应速度高于固定化绍胞的最大反应速度。由于细胞的固定化,影昀传质效应,同时内扩敞阻力会影响底物分子进入细胞进行反应,因此圈定化细胞的米氏常数高于游离细胞的米氏常数。关键词:天冬氨酸转氨酶苯丙氨酸大肠杆菌乒乓反应动力学酶分离纯化 ABSTRACT Aspartate aminotransferase catalyzes synthetic reactionanddegraded reaction of aromatic amino acid. Inthisdissertation,aspartate aminotransferase isabstracted and purified from ,then theenzyme characters haracters were alsoinvestigated, We use aseriesofsteps toabstractandpufffy aspartate anainotrmasferase,such as fractional precipitation of(NI-h)2804,hydrophobic interastion chromatography, ion—exchange chromatography,specific activity is enhanced ,mad the yield ofenzyme %.It isdeterminated thatmolecular mRS5 ofsubunit of AspAT isabout43000Da by SDS-PAGE Using purified study on enzyme characters,and the optimum temperature is50℃,the optimum pH i S thisreaction is transfer reaction ofdi—substrateand di·product,we only use Michadlis‘Menten equation to study haracter isdetermined thatapparent Km is 。 L-l,and apparent Vm“is ·L-~.Transferamination