文档介绍：宏基因组测序讲解
宏基因组测序
目的
研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介
宏基因组 ( Metagenome)(也称微生物环境基性状的筛选等。目前大肠杆菌是最为常用的宿主[14]，此外，链霉菌和假单胞菌也可以作为构建文库的宿主，不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。
宏基因组文库的筛选
由于环境基因组的高度复杂性，需要通过高通量和高灵敏度的方法来筛选和鉴定文库中的有用基因。筛选技术大致可分为四类:①基于核酸序列差异分析；②基于目的克隆功能的特殊代谢活性；③基于底物诱导基因的表达；④基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内的其他技术。
. 基于序列的筛选方法
通常根据已知相关功能基因的保守序列设计探针或PCR引物，通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆。用这种方法有可能筛选到某一类与已知序列相近的新基因，这一策略可以分离已知基因家族的新成员和含有高度保守区的酶基因[1516]。另一种方法是对含有16S rRNA等系统进化锚定基因的克隆进行测序或对文库随机测序[17]。优点是不必依赖宿主菌株来表达克隆基因，缺点是必须对相关基因序列有一定的了解，文库中那些和现有基因序列完全不一样的基因无法被筛选，故难以发现全新的活性物质，对鉴定新的基因成员有一定的局限性，也很难获得全序列。
直接序列分析法(sequencedriven screening method)是对所构建宏基因组文库的克隆进行随机测序分析，显然可以得到最多的信息[1820]。也可用鸟枪法对宏基因组文库进行测序，但需要进行大量的测序和分析工作，需大量人力、物力及财力。虽然DNA序列分析技术不断发展，但与个体微生物基因相比，宏基因组文库包含着巨大的序列片段，但对这些序列片段进行后续的分析则极为困难，结合其他的筛选方法可以得到更多的信息。
用微阵列技术(基因芯片)进行初步筛选，可以很大程度上减少测序量和后续的序列拼接等工作量。但微阵列技术在用于宏基因组文库筛选时，除了其本身由于交互杂交等导致的特异性低、灵敏度较差等缺点外，同样不能用于对未知功能基因的筛选，且检测不到环境中存在的那些低丰度微生物的序列[2122]。
基于功能的筛选方法
功能性筛选法是以活性测定为基础，通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆，然后通过序列和生化分析研究这些克隆。由于基于活性的筛选不需要已知序列的信息，故能较快地找到可用于工农业和医药的蛋白质和天然产物。功能性筛选的方法有两种，一种是对具有特殊功能的克隆子进行直接检测，如利用其在选择性培养基上(如含有化学染料和不可溶的或发光的酶反应底物)的表型特征进行筛选[23]。这种方法具有较高的灵敏度，可检测到较少的目的克隆。另一种方法是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功能互补生长的特性进行[24]。
功能性筛选法的优点是筛选过程比较简单、快速，只要基因能表达，就可以根据基因表达特性进行筛选，不需要复杂的实验过程。不足之处是这种筛选方法依赖于目的基因在新的宿主中表达，但使用模式微生物并不能把所有的宏基因组DNA表达出来，而且要求克隆到基因或基因簇的全长，一旦克隆过程中破坏基因某个组件将使得基因没法表达，也就不能根据功能进行筛选，故检出的概率很低，工作量大，往往从上万个克隆中只能筛选到几个有用的克隆。
底物诱导基因表达筛选(substrateinduced geneexpression screening, SIGEX)
SIGEX是用于能利用各种底物诱导的分解代谢型基因的检出，并结合生物发光技术用
来筛选代谢相关基因及酶基因[25]。由于编码相关代谢基因或酶基因通常呈簇存在，通常与该物质诱导的启动子和同源转录调控序列毗邻，往往在有底物诱导的条件下才表达，反之则不表达。首先构建一个含有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体，这个载体可将宏基因组DNA克隆到GFP基因上游，使该基因的表达受到
宏基因组DNA片段中的启动子调控。当外加目标底物时，可以影响GFP的表达，进而通过活细胞荧光分离技术(fluorescence activated cell sorting, FACS)，在添加特定底物的条件下对表达库进行筛选，就能够得到对该底物具有代谢活性的克隆。
SIGEX在宏基因组研究中具有很多优势，它提供了一个有效的和经济的检测手段，大大增加了筛选的容量和效率，节省了时间，为高通量筛选提供了保障，而且不需要对在颜色筛选中使用的底物进行修改，勿需担心因修改底物而产生毒性；且可以从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功能