文档介绍：第五章 聚合酶链式反应
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第五章 聚合酶链式反应
PCR 基因放大连琐反应
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)简称PCR，是以DNA为模板，利用DNA
时间（min）
温度
（℃）
适温延伸
3
高温变性
1
低温退火
2
重复1-3步,
循环20-30次
目的DN***段
扩增100万倍以上
DNA双螺旋
DNA单链
与引物复性
DNA变性
形成2条单链
子链延伸
DNA加倍
PCR的基本循环
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第一节 PCR扩增原理
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第二节 PCR体系
一、PCR反应操作程序
以30μl体系为例
各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: ×30 / 25 =
dNTPs: ×30 / 10 =
引物 P： ×30×2 / 10 =
Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 =
模板： 1μl
水： 30-3-----1=21μl
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第二节 PCR体系
一、PCR反应操作程序
操作示例： 5份标本 总体积 30μl ×6 = 180μl
1. 取一 ml Ep 管，依次加入下列试剂：
10×buffer： 3μl ×6 = 18μl
MgCl2: ×6 =
dNTPs: ×6 =
引物 P： ×6 =
Taq 酶 (5U/μl)： × 6 =
水： 21μl × 6 = 126μl
共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时
混匀（管壁上液体沉至管底）。
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第二节 PCR体系
一、PCR反应操作程序
2. 另取 5 Ep管，分别加入上述液体29μl。
3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。
4. 反应条件：PCR扩增仪
94 ℃ 5m ′, (94℃30″，55 ℃ 30 ″，72 ℃
1′， 35个循环)，72 ℃延伸 5 ′。
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第二节 PCR体系
二、PCR反应的成份
1. 缓冲液
10 ～ 50 mM Tris- Cl ()
维持 Taq 酶作用环境的偏碱性
25 ～ 50 mM KCl
促进引物退火，>50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。
100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA)
对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作
用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、
二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。
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第二节 PCR体系
二、PCR反应的成份
2. MgCl2
～ mM
Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。
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第二节 PCR体系
二、PCR反应的成份
3. dNTPs
dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物
～ mM
dNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度与dNTPs 浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓度高 ～ mM。
过高：加快反应速度，还可增