al-time_PCR.pdf

文档介绍：Real-time PCR
Xiao Jin
Applied Specialist
Molecular & Cellular Biology
Real-time PCR 原理
数学原理
化学原理
Real-time PCR 应用
绝对定量
相对定量
等位基因分型
阴阳性判定
microRNA
荧光定量PCR数学原理
基线阈值 Ct值[DNA]0
由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品
扩增结果存在很大的差异
同时扩增96的相同样品的结果
扩增曲线:四个阶段
性谱对数图谱线性图谱
平台期
线性增长期
指数增长期
基线期
平台期
线性增长期
指数增长期
基线期
基线阈值 Ct值[DNA]0
什么是基线?
基线就是扩增曲线中的水平部分。
线性图谱对数图谱
基线阈值 Ct值[DNA]0
什么是阈值?
1. 基线(空白)信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。
2. 偶然误差的结果满足对数分布。
3. 阈值= 基线(背景)信号标准偏差 x 10。
4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10-5。
5. 当荧光信号大于阈值时,可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。
基线阈值 Ct值[DNA]0
什么是CT值?
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数
线性图谱对数图谱
CT值 CT值
为什么CT值∝[DNA]0 ?
n N:产物分子数;N :起始分子数
N = N x (1+e) 0
0 e: 扩增效率; n: 循环次数
PCR理论方程只在指数期成立
线性期
lg [DNA]
指数期 y = x(1+e)n
循环数
为什么CT值∝[DNA]0 ?
n
Rn = RB + X0 (1+ e) Rs
第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB)加上每个分
子的荧光强度(即单位荧光强度,RS)与分子数目的乘积。
CT
设n=CT,则: RCT = RB + X0 (1+ e) Rs
lg (RCT -RB) = lg X0 + CT lg (1+ e) + lg Rs
CT lg (1+ e) = - lg X0 + lg (RCT -RB) –lgRs
log X O log( − BT − log) RRR S
CT −= +
+ E X )1log( + E X )1log(
即 CT = - k lg X0 + b (线性方程)