文档介绍：第二章分子克隆工具酶本课件是在网络资源基础上改进而成,在此对有关人士特致感谢! 第一节限制性内切酶第二节***化酶第三节 DNA 聚合酶第四节其他分子克隆工具酶在过去 20多年里,生物科学取得的许多革命性进步都直接来源于对基因的进一步认识和操作。基因操作或遗传工程的主要工具就是那些可在 DNA 分子上催化特异性反应的酶。酶的切割位点可作为 DNA 物理图的特殊标记,利用限制性内切酶可产生特定大小的 DNA 片段并使纯化这些 DNA 片段成为可能,获得的限制性 DNA 片段可作为 DNA 操作中的基本介质。对 DNA 进行修饰的工具的出现,为重组 DNA 的实现创造了条件。第一节限制性内切酶一、限制与修饰 1、限制与修饰现象: ?限制(restriction) :指一定类型的细菌可以通过限制性内切酶( restriction ednonuclease )的作用,破坏入侵的噬菌体 DNA ,导致噬菌体的寄主范围受到限制。限制作用实际就是限制性内切酶降解外源 DNA ,维护宿主遗传稳定的保护机制。?修饰(modification) :指寄主本身的 DNA ,由于在合成后通过***化酶( methylase )的作用得以***化,使 DNA 得以修饰, 从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用宿主细胞通过***化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。***化作用:最主要的碱基修饰,使腺嘌呤 A成为 N 6-***腺嘌呤, 胞嘧啶成为 5’-***胞嘧啶。 ?起始于 20世纪 60年代对细菌的研究。?至 2006 年2月,共发现 3773 种限制性内切酶, I、 II、 III型各有 68 、 3692 、 10 种,***化指导的 3种,商品化的 609 种, II 型中共有 223 种特异性。?限制酶是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列, 并由此切割 DNA 双链结构的核酸水解酶。?限制酶存在于细菌中,也存在于一些病毒中,真核生物中没有限制酶。?碱基对( base pair, bp ) 限制性核酸内切酶的命名原则?1973 . Smith 和D. Nathams 首次提出命名原则, 1980 年Roberts 在此基础上进行了系统分类①限制性核酸内切酶第一个字母(大写,斜体)代表该酶的宿主菌属名(genus); 第二、三个字母(小写,斜体)代表宿主菌种名(species) 。②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain) ,正体。③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶, 即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示, 正体写在第 4个字母之后,字母间无间隔。例: Eco RⅠ、 Hin dⅢ、 Sal Ⅰ限制性核酸内切酶的命名原则: 属名种名株名 H aemophilus in fluenzae strain d 流感嗜血杆菌d株 H indⅡH indⅢ同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 ?据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性,可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。?Ⅱ型限制酶用途大,多为同源二聚体,其中切口酶只在单链上产生切口, Ⅱs型识别序列和切割位置特殊。主要特性Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型酶分子识别位点切割位点限制与***化辅因子多寡,用途内切酶与***化酶不在一起 4-6bp ,多为回文序列识别序列内或附近特异切割分开的反应 Mg 2+种类多,用途大三亚基双功能酶二分非对称无特异性,距识别序列 1kb 处外互斥 ATP Mg 2+ SAM 种类少,用途小二亚基双功能酶 5-7bp 非对称距识别序列下游 24- 26bp 处同时竞争 ATP Mg 2+种类少,用途小 2017-4-10 西南大学生物技术专业基因工程 8 二、限制酶识别的序列 1、限制酶识别序列的长度(n) :一般为 4-8 个碱基对,最常见为 6bp 。识别位点出现频率: 4 n 2、限制酶识别序列的结构:多数为回文结构( palindrome ) 即镜像对称结构。一些酶可识别多种结构尤其是允许一些碱基是简并的, 还有一些酶识别序列呈间断对称,即回文对称序列之间可以间隔一定长度的任意碱基。 3、限制酶的切割位置:多数在识别序列内部,也有在外部、两端、两侧或单侧的。三、Ⅱ限制酶的功能和产生的末端类型?Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序,它以核酸内切方式水解 DNA 链中的磷酸二酯键,产生的 DNA 片段 5′端为P,3′端为 OH,识别序列一般为 4~6个碱基对,通常是反向重复顺序,具有 180 °的旋转对称性,即回文结构。?Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链 DNA 产生 3种不同的末端类型。 1、对称型突出末端:回文结构决定对称,分为 5’突出和 3’突出的粘性末端( cohesive/st