文档介绍：南昌大学医学院
硕士研究生毕业论文辩论会
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欢送各位专家光临指导
研 究 生 严青春
导 师 熊小亮 副教授
专 业 病理学与病理生理学
L〔1ng/ml〕及PDTC〔100μmol/ml〕组
〔10ng/ml〕及PDTC〔100μmol/ml〕组
〔100ng/ml〕及PDTC〔100μmol/ml〕组
〔100μmol/ml〕组
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对数生长期细胞
1×105
种板三块，每孔90 μl。再加
入不同浓度药物补足100 μl
实验分组如上。
培养箱中分别培养12h、24h、48h
培养箱中孵育4h后
每孔参加100 μl
三联液
全自动酶标仪测
570nm处吸收值。
计算细胞生存率及抑制率
并采用Weeb系数 判定联
合用药的相互作用
三、四***偶氮唑盐〔MTT〕比色法检测不同时间不同处理因素作用下Raji细胞的生长情况
离心3min后弃上清，
每孔各参加180 μl
1640液及20 μlMTT液
混匀
培养箱中放置24h
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PBS，5min ×2
%Triton X-100
中处理5min
PBS,5min×2
加100μL TdT酶
加100μL 2×SSC
室温15min
%的H2O2
3min
四、 TUNEL方法检测不同处理组细胞凋亡
收集细胞并涂片
自然枯燥后4％多聚
甲醛中固定25min
滴加100μL
Equilibration Buffer
室温平衡5min
吸去多余液体
37 ℃ 60min
PBS,5min×3
PBS,5min×3
100μL
Streptavidin-HRP
5min
PBS
5min×3
DAB显色
复染、透明、封片
显微镜下观察并拍
照、计算凋亡指数
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阳性结果判定：
TUNEL标记后， 凋亡Raji细胞核呈棕黄色。
阴性对照：
不添加TdT酶，其余与实验组步骤完全相同。
HE染色、光镜观察：
凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞
外表有“出芽〞现象。
计算凋亡指数(Apoptotic index, AI) ：
数4个高倍视野，分别计算凋亡细胞和总细胞数，
AI〔%〕=凋亡细胞数/总细胞数×100%
质量控制
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五、 免疫蛋白印迹
离心收集 不同处理24 h 后各组细胞
每管加3ml， 4℃PBS 并吹打成悬液
离心，去上清×3次
每管细胞加400 l含PMSF的裂解液，冰上充分裂解〔30min〕
4 ℃12000rpm离心5min
收集上清并分装保存 于－20℃ 冰箱中同时测蛋白含量
总蛋白提取示意图
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核蛋白提取试剂盒操作示意图
收集不同处理24h后各组细胞
每管加400μL预冷的BufferA
剧烈振荡15s 后置于冰上15min
参加11μL冷BufferB
剧烈振荡5s后于冰上1min
剧烈振荡5s后4℃离心，16000×g，5min
收集上清〔浆蛋白〕后往沉淀物中参加100μL冷BufferC
每10min振荡15s
剧烈振荡15s置
于冰上40min
每管加3ml， 4℃PBS 并吹打成悬液
离心，去上清×3次
4℃ 16000×g离心10min
收集上清并分装保存 于－20℃ 冰箱中同时测蛋白含量
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western blotting检测膜蛋白DR4、DR5及核内NF-κB蛋白的表达
从－20℃ 冰箱中
取出蛋白样
沸水中煮5min
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统计处理
计数量资料采用±s表示, 进行方差分析，组间比较用LSD法
Western Blotting图片用Imagetool软件进行灰度值分析,行单因素的方差分析
以P＜, P＜
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结果
培养12 h后细胞单个呈圆形，透亮，悬浮在细胞培养液中：24 h后，细胞圆形，透亮，悬浮在培养液中，三两个细胞开始出现抱团现像，48 h后，细胞抱团现象普遍。
Raji:12h 10×25
Raji:24h 10×25
Raji:48h 10×25
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