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几种菌种的保存与复方法〔含扩增方法〕 定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进展保存并间隔一定时间进展移植培养的菌种保筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用10%盐酸浸泡，如河沙中有机物较多可用20%盐酸浸泡。24小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干或晒干。 另取地面下40～60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100目过筛,水洗至中性，烘干。 将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121℃湿热灭菌30min。 随机抽取灭菌后的砂土管假设干支，无菌条件下取少许砂土至营养肉汁培养基中，30℃培养24小时，检查无微生物生长后方可使用。2 斜面培养物的制备 参照定期移植法。3 制备菌悬液 向培养好的斜面培养物中注入3～5mL无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，～。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。4 枯燥 真空抽去沙土管中水分。5 保藏 将沙土管用火焰熔封后存放于低温(4～6℃)枯燥处保藏，每隔半年检查一次菌种存活性与纯度。或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置枯燥器保存。 保藏时间2～10年。6 恢复培养 无菌条件下打开沙土管，取局部沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。冷冻枯燥 将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。 操作步骤如下：好氧菌冷冻枯燥管的制备1 安瓿管准备 安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，枯燥后、贴上标签，标上菌号与时间，参加脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。2 保护剂的选择和准备 保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度与pH值，以与灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。3 冻干样品的准备 在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进展纯度检查后〔参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》〔试行〕〕，与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜〔以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-，只需10毫升琼脂斜面两支〕。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，-，假设是球形安瓿管，装量为半个球部。假设是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。4 预冻 一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。5 冷冻枯燥 采用冷冻枯燥机进展冷冻枯燥。 将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻枯燥机的枯燥箱，开始冷冻枯燥，时间一般为8-20小时。6 真空封口与真空检验 将安瓿